miRNA-711在細(xì)胞外結(jié)合并激活TRPA1以引起急性和慢性瘙癢

越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞外miRNAs可能作為疾病的生物標(biāo)志物，但細(xì)胞外miRNA的生理相關(guān)性尚不清楚。8月8號(hào)杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究人員在《Neuron》上發(fā)表論文，該論文發(fā)現(xiàn)面頰皮內(nèi)注射miR-711在首次接受試驗(yàn)的小鼠中可誘導(dǎo)TRPA1依賴性瘙癢（刮擦）而沒(méi)有疼痛（擦拭）。細(xì)胞外灌注miR-711可通過(guò)核心序列GGGACCC在TRPA1表達(dá)的異源細(xì)胞和固有感覺(jué)神經(jīng)元中誘導(dǎo)TRPA1。計(jì)算機(jī)模擬顯示，核心序列結(jié)合TRPA1胞外S5-S6環(huán)上的幾個(gè)殘基，這些殘基對(duì)miR-711激活TRPA1至關(guān)重要，而不是異硫氰酸烯丙酯。在免疫缺陷小鼠中，皮內(nèi)接種人類Myla細(xì)胞會(huì)誘發(fā)淋巴瘤和慢性瘙癢，這與癌細(xì)胞分泌的血清miR-711水平升高有關(guān)。miR-711抑制劑和阻斷肽可破壞miR-711/TRPA1相互作用，從而可抑制淋巴瘤誘導(dǎo)的慢性瘙癢。研究結(jié)果證明了細(xì)胞外miRNA作為瘙癢介質(zhì)和離子通道調(diào)節(jié)因子的非常規(guī)生理作用。

研究路線：

研究結(jié)果：

圖1 皮內(nèi)miR-711通過(guò)GGGACCC核心序列和TRPA1誘導(dǎo)瘙癢但不疼痛

（A）皮內(nèi)注射含有miRNA的GGGACCC（B）mmu-miR-711誘導(dǎo)的劃痕在Trpa1 - / -而不是Trpv1 - / -和Tlr7 - / -小鼠中降低。（C）在該研究中測(cè)試的miRNA的序列。（D）mmu-miR-711的序列和mmu-miR-711的6個(gè)突變體。（E）通過(guò)皮內(nèi)注射mmu-miR-711及其突變體（1mM，5μL）誘導(dǎo)的劃痕。（F）核心序列GGGACCC而不是突變序列AAAAAAA足以在幼稚小鼠中引起刮擦而不是擦拭。（G）熱痛覺(jué)過(guò)敏。（H）機(jī)械異常性疼痛（I）伊文思藍(lán)染色的后爪的圖像。（J）同側(cè)和對(duì)側(cè)后爪中伊文思藍(lán)染色的定量。

圖2 miR-711 在異源細(xì)胞中激活TRPA1

（A）由mmu-miR-711和核心序列誘導(dǎo)的內(nèi)向電流痕跡。（B）由AITC（50μM），miRNA（10μM），核心序列，突變RNA 寡核苷酸和A967079的作用誘導(dǎo)的內(nèi)向電流的定量（振幅）。（C）劑量 - 反應(yīng)曲線，比較由mmu-miR-711和AITC誘導(dǎo)的內(nèi)向電流的幅度。（D）由AITC和mmu-miR-711引起的內(nèi)向電流的潛伏期。（E）由mmu-miR-711，AITC和mmu-miR-711 + A967079引發(fā)的I / V曲線。（F）誘導(dǎo)的內(nèi)向電流的痕跡激動(dòng)劑的TRPV1 ，TRPV2 ，TRPV3，和 TRPV4。（G）（F）中描述的內(nèi)向電流的量化。（H）單渠道活動(dòng)的痕跡。（I）單通道開(kāi)放時(shí)間和開(kāi)放概率的量化。（J）單渠道活動(dòng)的痕跡。（K）單通道開(kāi)放時(shí)間和開(kāi)放概率的量化。

圖3 DRG培養(yǎng)物中的鈣成像顯示Pirt-GCaMP3小鼠中miR-711 激活TRPA1表達(dá)感覺(jué)神經(jīng)元亞群

（A）mmu-miR-711，組胺 ，氯喹 和AITC的代表性圖像。 （B）mmu-miR-711，組胺，CQ和AITC的神經(jīng)元鈣響應(yīng)。（C）維恩圖顯示miR-711-響應(yīng)神經(jīng)元和組胺- ，CQ-和AITC-響應(yīng)神經(jīng)元之間的重疊以及培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中每個(gè)群體的百分比。

圖4 miR-711 通過(guò)小鼠DRG神經(jīng)元中的TRPA1 誘導(dǎo)內(nèi)向電流和動(dòng)作電位

（A）內(nèi)向電流的痕跡。（B）內(nèi)向電流的幅度。（C）miR-711和AITC在WT和Trpa1 - / -小鼠中的小直徑小鼠DRG神經(jīng)元中誘導(dǎo)的動(dòng)作電位。（D和E）miR-711和AITC在WT小鼠中的小直徑DRG神經(jīng)元中誘導(dǎo)的不同動(dòng)作電位。（D）動(dòng)作電位的痕跡。（E）動(dòng)作電位的上升時(shí)間或閾值時(shí)間的定量，在（D）中和在超極化振幅之后表示為（1），如（D）中的（2）所示。

圖5  miR-711核心序列與hTRPA1細(xì)胞外環(huán)結(jié)合的計(jì)算機(jī)模擬及結(jié)合位點(diǎn)的鑒定

（A）與hTRPA1細(xì)胞外表面結(jié)合的核心序列GGGACCC的結(jié)構(gòu)。 （B）與TRPA1細(xì)胞外表面結(jié)合的GGGACCC的縮放視圖。（C）hTRPA1殘基與GGGACCC之間的接觸頻率。（D）GGGACCC的分布估計(jì)通過(guò)200萬(wàn)步RexDMD模擬收集的hTRPA1的結(jié)合能。從結(jié)合能等于-75kcal / mol開(kāi)始，分布的左肩表征高親和力GGGACCC / TRPA1復(fù)合物的構(gòu)象整體。（E）具有亞基1的詳細(xì)殘基的hTRPA1的示意圖。（F）由mmu-miR-711誘導(dǎo)的表達(dá)mmu-TRPA1或其突變體的CHO細(xì)胞的內(nèi)向電流痕跡。（G）ATIC和mmu-miR-711誘導(dǎo)電流的定量。

圖6 miR-711 / TRPA1與阻斷肽相互作用的破壞減少了瘙癢

（A）RNA pull-down測(cè)定顯示hTRPA1與生物素綴合的mmu-miR-711結(jié)合。（B）RNA pull-down顯示野生型mmu-miR-711與bio-mmu-miR-711競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合hTRPA1。（C）（B）中所示的mmu-miR-711 / hTRPA1結(jié)合活性的定量。（D）活細(xì)胞標(biāo)記顯示Cy3標(biāo)記的mmu-miR-711與培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元表面上的mTRPA1的結(jié)合。（E）RNA pull-down測(cè)定顯示阻斷肽破壞mmu-miR-711 / hTRPA1相互作用，但不破壞突變肽。（F）表達(dá)hTRPA1的HEK293細(xì)胞中阻斷肽對(duì)mmu-miR-711誘導(dǎo)的內(nèi)向電流的抑制。（G）（F）中內(nèi)向電流的量化。（H）阻斷肽抑制皮內(nèi)注射mmu-miR-711誘導(dǎo)的小鼠瘙癢。

圖7 CTCL的小鼠模型顯示慢性瘙癢和miR-711上調(diào)

（A）通過(guò)皮內(nèi)注射CD4 + Myla細(xì)胞接種后15,20,25,30和40天背皮上的淋巴瘤圖像（B）CTCL后正常和荷瘤皮膚的DAPI染色圖像。（C）接種CD4 + Myla細(xì)胞后腫瘤直徑顯示腫瘤生長(zhǎng)的時(shí)間過(guò)程。（D）CTCL誘發(fā)的慢性瘙癢的時(shí)間過(guò)程。（E）CTCL小鼠的hsa-miR-21，hsa-miR-155，hsa-miR-326和hsa-miR-711的血清水平。（F）原位雜交（紅色）顯示CTCL誘導(dǎo)后20天在背部皮膚上的淋巴瘤細(xì)胞中的hsa-miR-711表達(dá)。（F'）（F）中的擴(kuò)大框顯示單染色和雙染色。（G）在CTCL的不同時(shí)間每平方毫米背部皮膚定量hsa-miR-711陽(yáng)性細(xì)胞。

圖8 miR-711抑制劑，TRPA1 拮抗劑和miR-711 / TRPA1相互作用阻斷肽在CTCL小鼠模型中對(duì)慢性瘙癢的抑制作用

（A）通過(guò)皮內(nèi)注射hsa-miR-711抑制劑和TRPA1拮抗劑，抑制CTCL誘發(fā)的慢性瘙癢。（B）在Myla細(xì)胞接種后20天給予阻斷肽對(duì)CTCL誘發(fā)的慢性瘙癢的抑制。（C）在接種前通過(guò)慢病毒在Myla細(xì)胞中過(guò)表達(dá)hsa-miR-711抑制劑減弱CTCL后的慢性瘙癢。（D）通過(guò)腺病毒過(guò)表達(dá)hsa-miR-711誘導(dǎo)皮膚AV注射在背部皮膚上后持續(xù)瘙癢。（E）皮內(nèi)注射A-967079，hsa-miR-711抑制劑和阻斷肽。