國(guó)自然熱點(diǎn)之焦亡

細(xì)胞焦亡又稱細(xì)胞炎性壞死，是一種最新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡方式。主要通過炎癥小體介導(dǎo)包含Caspase-1在內(nèi)的多種Caspase的激活，造成包括GSDMD在內(nèi)的多種Gasdermin家族成員發(fā)生剪切和多聚化，造成細(xì)胞穿孔，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡。相比于細(xì)胞凋亡，細(xì)胞焦亡發(fā)生的更快，并會(huì)伴隨著大量促炎癥因子的釋放，在形態(tài)學(xué)上同時(shí)具有壞死和凋亡的特征。近年來在國(guó)自然基金中標(biāo)項(xiàng)目中細(xì)胞焦亡相關(guān)項(xiàng)目日益增多，且增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯。

乳腺癌 (BrCa) 是最常見的癌癥，也是女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。隨著乳腺篩查的發(fā)展，5年相對(duì)生存率有所提高，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性BrCa的治療仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。今天我們講一篇關(guān)于乳腺癌焦亡的文章，該文章題名為Tumor suppressor DRD2 facilitates M1 macrophages and restricts NF-κB signaling to trigger pyroptosis in breast cancer，2021年3月5日發(fā)表于Theranostics期刊。

DRD2通過 BrCa 中的啟動(dòng)子甲基化被轉(zhuǎn)錄下調(diào)

為了研究新的潛在腫瘤抑制基因 (TSG)，使用BrCa組織和正常組織進(jìn)行 測(cè)序篩選。發(fā)現(xiàn)與正常乳腺組織相比，BrCa組織中DRD2的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。通過IHC染色，與BrCa組織相比，在正常乳腺組織中也發(fā)現(xiàn)了更高的DRD2蛋白水平。TCGA數(shù)據(jù)顯示，在BrCa中DRD2 mRNA的下調(diào)，并且DRD2的啟動(dòng)子甲基化在BrCa中也更頻繁。在另一個(gè)數(shù)據(jù)庫MethHC上進(jìn)一步分析了表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。與DRD3和DRD4不同，發(fā)現(xiàn)DRD2伴隨啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)被下調(diào)?；?/span>TCGA數(shù)據(jù)庫分析BrCa患者DRD2表達(dá)與病理特征的關(guān)系。DRD2的高表達(dá)與患者年齡呈負(fù)相關(guān)。此外，在HER2 陰性患者中DRD2表達(dá)較高。還分析了DRD2啟動(dòng)子甲基化與病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果表明，DRD2甲基化增加在老年人群中更為常見?；?/span>Kmplot，DRD2 的更高表達(dá)促進(jìn)了BrCa患者的更長(zhǎng)生存期，這在HER2陽性基因型患者中也可見。但是這種優(yōu)勢(shì)在患者中沒有看到。根據(jù)RT-PCR和MSP結(jié)果，與永生化的正常乳腺細(xì)胞系相比，幾乎所有BrCa細(xì)胞系中都可以看到DRD2 mRNA表達(dá)的下調(diào)以及的啟動(dòng)子甲基化。因此，DRD的高甲基化頻率可能有助于其下調(diào)BrCa。用 Aza進(jìn)行藥理去甲基化恢復(fù)了兩個(gè)BrCa細(xì)胞系MDA-MB231和BT549中DRD2的表達(dá)。DRD2 是一種潛在的 TSG，也是預(yù)測(cè) BrCa 患者預(yù)后的有希望的生物標(biāo)志物。

DRD2 作為 TSG 起作用并抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT)

構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)DRD2的MDA-MB231和BT549細(xì)胞并通過RT-PCR和WB驗(yàn)證。DRD2的過表達(dá)抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如CCK8 測(cè)定所證明的。并且DRD2也損害了生存能力，如克隆形成試驗(yàn)所示和軟瓊脂形成試驗(yàn)。DRD2表達(dá)顯著促進(jìn)BrCa細(xì)胞凋亡并在G2/M階段阻斷MDA-MB231和BT549。此外，DRD2的過表達(dá)促進(jìn)了BrCa細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性。在劃痕試驗(yàn)中，DRD2 的異位表達(dá)表現(xiàn)出比對(duì)照組更小遷移能力。DRD2的過表達(dá)顯著降低了BrCa遷移和侵襲。在體內(nèi)進(jìn)一步確定了DRD2的腫瘤抑制作用。皮下腫瘤模型表明源自 DRD2 過表達(dá)模型的腫瘤體積和重量均減少。

EMT在癌細(xì)胞的遷移和侵襲中很重要。在DRD2過表達(dá)后，MDA-MB231 和 BT549 的形態(tài)變?yōu)樯掀宇愋汀?/span>WB結(jié)果表明 E-鈣粘蛋白的表達(dá)增加，波形蛋白以及另一種前 EMT 轉(zhuǎn)錄因子 ZEB1 的表達(dá)降低。IF染色還表明DRD2的異位表達(dá)誘導(dǎo)MDA-MB231失去間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白并獲得上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白。總之，DRD2 能夠在體外和體內(nèi)抑制腫瘤發(fā)生，并且 DRD2 還抑制 BrCa 細(xì)胞的 EMT。

DRD2 轉(zhuǎn)染的 BrCa 促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 表型

據(jù)報(bào)道，DRD2以前調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M的極化。在這項(xiàng)研究中，來自BrCa患者的IHC結(jié)果表明，在具有較高 DRD2 表達(dá)的 BrCa 組織中，M1巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增加，M2巨噬細(xì)胞的濾過減少。為了進(jìn)一步研究DRD2在調(diào)節(jié)TAM中的功能，構(gòu)建了BrCa和巨噬細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)。當(dāng)巨噬細(xì)胞與表達(dá) DRD2的BrCa 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，如qRT-PCR所示，M1 表型的標(biāo)志物增加，而M2巨噬細(xì)胞 標(biāo)志物下調(diào)。qRT-PCR 還證實(shí)載體轉(zhuǎn)染的BrCa細(xì)胞將巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)為M2型。WB結(jié)果確定M1標(biāo)志物iNOS被過表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞上調(diào)，而M2標(biāo)志物CD206 被下調(diào)。IF染色顯示巨噬細(xì)胞在與表達(dá)DRD2的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后表現(xiàn)出M1表型。上述結(jié)果表明BrCa中的DRD2具有將巨噬細(xì)胞重編程為M1表型的能力。

為了探索將巨噬細(xì)胞極化為M1表型的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，進(jìn)行了細(xì)胞因子陣列分析。結(jié)果表明，誘導(dǎo)M1極化的兩種經(jīng)典細(xì)胞因子TNFα和IFN γ沒有增加。然而，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，DRD2 顯著下調(diào)IL-6和IL-10。進(jìn)一步證實(shí)IL-6和IL-10的下調(diào)。因此，DRD2可以將巨噬細(xì)胞重新編程 M1表型，并在串?dāng)_期間顯著下調(diào)IL-6和IL-10。

DRD2 重編程的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的焦亡

來自小鼠模型的攜帶 DRD2 的腫瘤表現(xiàn)出增加的腫瘤細(xì)胞死亡，如 HE 所示。在IHC染色中，表達(dá) DRD2 的腫瘤樣本顯示更高的 pMLKL 表達(dá)。根據(jù) TUNEL 測(cè)定，DRD2 還促進(jìn)了體內(nèi)細(xì)胞凋亡。GSDM而不是GSDMD被DRD2 上調(diào)。巨噬細(xì)胞在串?dāng)_過程中進(jìn)一步促進(jìn)了DRD2轉(zhuǎn)染的BrCa細(xì)胞GSDME的表達(dá)。在表達(dá)DRD2的BrCa細(xì)胞中，IL-1β 也被巨噬細(xì)胞上調(diào)。WB 結(jié)果所表明，DRD2誘導(dǎo)MLKL的磷酸化，在共培養(yǎng)過程中被巨噬細(xì)胞抑制。此外，DRD2 表達(dá)激活了caspase-8。假設(shè)，DRD2 可能在與巨噬細(xì)胞的串?dāng)_期間誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。當(dāng)在BrCa細(xì)胞中與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，NLRP3的組裝在表達(dá)DRD2的BrCa 細(xì)胞中被觸發(fā)。IL-1β和IL-18的成熟也被激活的caspase-1蛋白水解誘導(dǎo)。Cleaved caspase-3在共培養(yǎng)過程中被上調(diào)。切割的caspase-3可以切割GSDME的N端。此外，在共培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)GSDME的N端在BrCa細(xì)胞中被切割并表達(dá)DRD2。為了確定細(xì)胞焦亡是否由M巨噬細(xì)胞觸發(fā)，使用LPS誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基，結(jié)果表明巨噬細(xì)胞僅觸發(fā)NLRP3組裝并切割具有DRD2表達(dá)的BrCa細(xì)胞中的GSDME。上述結(jié)果表明 DRD2 可以誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡 (PCD)，包括細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡，并且這些事件被巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為細(xì)胞焦亡。并且M1巨噬細(xì)胞以 DRD2依賴性方式觸發(fā) BrCa 細(xì)胞的焦亡。

DRD2 通過中斷 TAK1 的磷酸化來限制 NF-κB 信號(hào)激活

NF-κB信號(hào)的激活對(duì)于觸發(fā)炎性體組裝和隨后的細(xì)胞焦亡至關(guān)重要。探索DRD2對(duì)NF-κB活化的影響。IF染色表明DRD2幾乎阻斷p-p65的核轉(zhuǎn)位，但是這種抑制被巨噬細(xì)胞抵消了。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的提取物也表明DRD2抑制p-p65的核易位。如WB結(jié)果所示，DRD2通過LPS刺激抑制了IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化。異位DRD2表達(dá)也顯著抑制了巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的p65磷酸化和 IKKα/β的上游激活。WB結(jié)果顯示 DRD2下調(diào) ICAM-1，NF-κB 的下游靶標(biāo)。然而，這種下調(diào)被巨噬細(xì)胞抵消。IKKα/β磷酸化的抑制表明DRD2負(fù)介導(dǎo)IKK 復(fù)合物的上游。TAK1在催化IKKα和IKKβ中起著關(guān)鍵作用。TAK1的磷酸化被異位DRD2表達(dá)顯著抑制。一般而言，DRD2 通過中斷其上游激酶 TAK1 來抑制NF-κB信號(hào)激活。

作為典型的G蛋白偶聯(lián)受體，DRD2的內(nèi)在化誘導(dǎo)質(zhì)膜招募其適配器β-arrestin2的的并且增加了其親和力結(jié)合β-arrestin2的。LPS和CM刺激了DRD2和β-arrestin2的蛋白-蛋白結(jié)合。IF染色DRD2似乎與LPS處理的細(xì)胞質(zhì)中的p-p65結(jié)合，并且結(jié)合被Co-IP和IB進(jìn)一步證實(shí)。本研究還證實(shí)內(nèi)化的DRD2可以促進(jìn)TAB1與β-arrestin2的結(jié)合，并削弱TAB1與TAK1的結(jié)合最重要的是，DRD2 激活的 β-arrestin2 通過與TAB1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來拮抗TAK1的磷酸化。

DRD2通過下調(diào)DDX5和eEF1A2抑制NF-κB通路激活和腫瘤發(fā)生

異位 DRD2表達(dá)顯著抑制p65和 NF-κB 靶基因IL-10的mRNA表達(dá)，表明在沒有配體激活的情況下，DRD2是NF-κB通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子。除了結(jié)合激活 β-arrestin2，DRD2 還可能以其他方式抑制 NF-κB 信號(hào)。為了研究機(jī)制，通過 Co-IP 結(jié)合MS分析來鑒定結(jié)合蛋白質(zhì)。在MDA-MB231和BT549細(xì)胞的所有結(jié)合蛋白中，DDX5、eEF1A2和ICAM-1都被證實(shí)被異位DRD2表達(dá)下調(diào)。DDX5和EEF1A2有幾種癌癥型號(hào)的癌基因。WB也證實(shí)了DDX5和eEF1A2 的下調(diào)蛋白水平。在293T和MDA-MB231中，通過 Co-IP 和 IB 測(cè)定證實(shí)了DRD2、DDX5和eEF1A2 的結(jié)合，表明這三種蛋白質(zhì)形成了復(fù)合物。還揭示了293T和 MDA-MB231中 DDX5和p50之間的結(jié)合。此外，據(jù)報(bào)道，DRD2 與神經(jīng)系統(tǒng)中的 EGFR 結(jié)合。在BrCa細(xì)胞中，DRD2和EGFR的結(jié)合也在293T和MDA-MB231中得到證實(shí)。并且DRD2表達(dá)下調(diào)ERBB1（EGFR）和ERBB2（HER2）表達(dá)，它們也是 NF-κB 的靶基因。而在DRD2過表達(dá)的BrCa細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn) DDX5促進(jìn) IκBα和p65的磷酸化。eEF1A2被證明可以直接強(qiáng)烈增加p-p65而不影響IKKα/β或IκBα，并且 eEF1A2在表達(dá) DRD2 的 MDA-MB231 中甚至在沒有 LPS 的情況下上調(diào)p-p65 的蛋白質(zhì)水平。上述結(jié)果表明，DRD2過表達(dá)抑制了 DDX5 和 eEF1A2 對(duì)促進(jìn) NF-κB 信號(hào)激活影響顯著。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí) DRD2 抑制 NF-κB 信號(hào)激活并通過下調(diào) BrCa 細(xì)胞中的 DDX5 和 eEF1A2 發(fā)揮腫瘤抑制作用。