FLT4/VEGFR3激活AMPK，以協(xié)調糖代謝重編程與自噬和炎癥小體激活

巨噬細胞快速進行糖酵解重編程響應巨噬/自噬，炎癥小體激活和清除細菌。識別參與其中的關鍵分子將提供關鍵的潛在治療應用。作者在本研究中闡明了LT4-AMPK模塊協(xié)調糖酵解重編程、自噬、炎癥小體激活和焦死來消滅入侵細菌的分子機制。本研究2021年10月發(fā)表在《AUTOPHAGY》，IF=9.77。

技術路線：

主要結果：

1.     FLT4/VEGFR3激活AMPK，以協(xié)調糖代謝重編程與自噬和炎癥小體激活，以消除細菌

為了了解糖酵解重編程的改變是如何與細菌清除聯(lián)系在一起的，作者在flt4^WT/WT(野生型)小鼠細胞內感染來源于鼠傷寒菌株SL1344菌株后，檢測了靶器官肝臟中的糖代謝譜和傷寒鏈球菌的數量。結果發(fā)現具有直接抗菌活性的檸檬酸和NAD (P) H在肝臟感染后大量增加。相比之下，與PBS處理的flt4^WT/WT小鼠相比，SL1344感染的flt4^WT/WT小鼠肝臟中琥珀酸鹽和乳酸鹽的濃度降低，可促進促炎巨噬細胞功能(Figure 1A)。因為之前證明了flt4突變小鼠缺乏細胞外配體結合域(LBD:缺乏免疫球蛋白樣域2和3，命名為flt4^ΔLBD/ΔLBD)更容易感染。因此，作者比較了Flt4^WT/WT小鼠和flt4^ΔLBD/ΔLBD小鼠的糖酵解重編程變化。與Flt4^WT/WT小鼠不同， flt4^ΔLBD/ΔLBD小鼠檸檬酸和NAD(P)H未能增加。此外，Flt4^WT/WT小鼠琥珀酸和乳酸的產量減少，而突變小鼠顯示出這些代謝物的產量增加(Figure 1B-F)。此外，flt4^ΔLBD/ΔLBD小鼠肝臟和脾臟中鼠鼠傷寒桿菌數量顯著增加(Figure 1G)。

作者通過評估巨噬細胞內鼠傷寒鏈球菌的菌落形成單位(cfu)來研究FLT4如何影響細菌清除。與體內抗細菌反應缺陷相似，flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細胞與Flt4WT/WT巨噬細胞相比，攜帶的鼠傷寒桿菌數量要多得多。 由于包括巨噬細胞在內的吞噬細胞可以吞噬固體顆粒，這是殺死細菌的關鍵過程，作者首先檢測了FLT4信號通路是否影響吞噬能力。將GFP(綠色熒光蛋白)-大腸桿菌(e.c oli-GFP)與flt4ΔLBD/ΔLBD小鼠或與flt4WT/WT同窩的小鼠的腹腔滲出物巨噬細胞PEM(腹腔滲出物巨噬細胞)共孵育，流式細胞術檢測結果顯示flt4ΔLBD/ΔLBD PEMs對大腸桿菌GFP的吞噬量低于Flt4WT/WT PEMs (Figure 1I)。溶酶體的酶可以幫助巨噬細胞消滅細菌。接下來，作者評估了吞噬酶體的成熟是否受到flt4的調控。聚焦顯微鏡成像顯示內化的鼠傷寒桿菌GFP與裝載LysoTracker Red的野生型BMDMs共定位(Figure 1J)。綜上所述，作者的數據表明，flt4可以通過增加吞噬、ROS的產生和自噬小體的成熟來促進細菌的清除，并伴隨著糖代謝的改變。

Fig 1 巨噬細胞表面受體flt 4控制糖酵解重編程和細菌清除

2.     FLT4在清除鼠傷寒桿菌過程中保護巨噬細胞免遭細胞凋亡

鼠傷寒鏈球菌感染可導致巨噬細胞凋亡，其特征是細胞腫脹，膜囊迅速擴張、破裂和核凝結。在圖2A中，在傷寒沙門氏菌感染期間，flt 4ΔLBD/ΔLBDPEMs細胞死亡數量增加，呈腫脹形狀(Figure 2B)，在FLT4WT/WT巨噬細胞中，存在大量含有細菌殘體的吞噬-溶酶體空泡。感染的flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細胞的細胞死亡率高于Flt4WT/WT細胞(Figure 2C, D)。由于甘氨酸處理可降低胞質釋放水平乳酸脫氫酶(LDH)和保護細胞免于焦亡，作者用這個方法來鑒定焦亡。作者發(fā)現甘氨酸治療可以保護flt4ΔLBD/ΔLBD或Flt4WT/TKmut的巨噬細胞，其保護水平與WT細胞在傷寒沙門氏菌感染后的保護水平相當(Figure 2E）?？傊?，這些數據表明，flt4保護巨噬細胞免受SL-1344感染引起的細胞凋亡。

炎癥小體的激活和隨后的焦亡是抵抗細菌感染的關鍵防御。因此，作者通過ELISA分析細胞上清液中成熟IL1B濃度來研究炎癥小體的活化。事實上，FLT4ΔLBD/ΔLBD PEMs或BMDMs分泌的IL1B水平遠高于對照細胞(Figure 2F, G)。此外，flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細胞中IL1B的增加與感染FLT4ΔLBD/ΔLBD小鼠的葡萄糖代謝產物包括琥珀酸和乳酸鹽的增加是一致的(Figure 1A)，這兩者都被認為是促進炎癥的。已有研究報道CASP1和GSDMD (蛋白D)誘導細胞焦亡，這可能對許多細菌有保護作用。然而，體內炎癥小體信號的過度激活和焦亡可能對宿主有害。在作者的研究中，作者觀察到IL1B濃度越高，細胞焦亡率越高，而細菌數量越多。

Fig 2 FLT4在清除鼠傷寒桿菌過程中保護巨噬細胞免遭細胞凋亡。

3.     FLT4抑制炎癥小體和CASP1的激活鼠鼠傷寒桿菌感染巨噬細胞

在炎性小體組裝過程中，成熟IL1B的釋放需要CASP1激活來切割前體pro-IL1B。炎性小體激活的另一個信號是PYCARD/ASC (PYD和CARD結構域包含/凋亡相關斑點樣蛋白包含CARD)斑點的形成，它是CASP1激活的平臺。作者發(fā)現在flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細胞中形成了較高比例的PYCARD斑點(Figure 3A)。與傷寒沙門氏菌感染的Flt4WT/ WT相比，檢測對照細胞的蛋白質齊聚狀態(tài)(Figure 3B)。結果表明，FLT4信號通路抑制細菌感染后巨噬細胞PYCARD斑點的形成。

接下來，作者測量了FLT4如何影響CASP1的激活。CASP1是一種關鍵酶，它能切割前il1b /白介素-1β蛋白轉化為活性IL1B。CASP1與炎性小體一起能誘導其自催化活性和自裂解，從而產生催化活性亞基CASP1 / p10及CASP1 / p20。與對照組細胞相比，感染沙門氏菌之后， flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細胞顯示出CASP1以CASP1/p20裂解表達形式增加(Figure 3C)。同樣，感染沙門氏菌之后， 激酶死亡突變體Flt4WT/TKmut或FLT4的敲除顯著增強了CASP1/p10的裂解形式(Figure 3D, E)。這些數據表明，FLT4信號通路抑制炎性小體的激活。

LPS啟動傷寒沙門氏菌感染迅速誘導VEGFC蛋白表達(Figure 3F)。而外源性VEGFC可以降低Flt4WT/WT巨噬細胞中CASP1的激活(Figure 3G)。而FLT4抑制劑則增強了Flt4WT/WT巨噬細胞中CASP1的活化(Figure 3H)。使用外源性VEGFC和FLT4抑制劑的治療并沒有進一步影響flt4ΔLBD/ΔLBD巨噬細胞中CASP1的激活(Figure 3G, H)。這些結果說明在傷寒鏈球菌感染的巨噬細胞中，FLT4信號通路的激活抑制了炎癥小體觸發(fā)的PYCARD斑點的形成和CASP1激活。

Fig 3 FLT4抑制鼠傷寒桿菌感染巨噬細胞的炎癥小體和CASP1的激活

4.     FLT4以自噬依賴的方式增強細菌消除和防止炎性小體激活

在巨噬細胞識別病原體或吞噬細胞質細菌的過程中，MAP1LC3以胞質形式與磷脂酰乙醇胺結合形成MAP1LC3-磷脂酰乙醇胺結合物(MAP1LC3 -II)，它被招募到吞噬細胞膜上。成熟后，自噬體與溶酶體融合，降解和清除入侵的病原體，這也被稱為自噬體。作者通過電子顯微鏡發(fā)現細菌降解野生型巨噬細胞顯示邊緣不規(guī)則 (Figure 4A)。

自噬酶體形成的過程涉及到吞噬體和自噬機制的組成部分。因此作者用免疫印跡法測量了鼠傷寒桿菌感染野生型或flt4?LBD/?LBD巨噬細胞中的MAP1LC3-I和MAP1LC3-II水平。結果發(fā)現，寒沙門氏菌感染提高了野生型巨噬細胞中MAP1LC3-II:MAP1LC3-I的比值，而flt4?LBD/?LBD巨噬細胞中MAP1LC3-II水平顯著降低(Figure 4B)。 在永生化小鼠骨髓來源的巨噬細胞（iBMDM）細胞中過表達FLT4或外源性VEGFC處理均提高了MAP1LC3-II水平(Figure 4C, D)。此外，用FLT4抑制劑或自噬藥物抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Ma)處理降低了MAP1LC3-II水平(Figure 4E, F)。這些發(fā)現表明，FLT4信號通路以map1lc3依賴的方式增強了自溶酶體的形成。與Flt4 WT/WT 巨噬細胞相比，flt4?LBD/?LBD巨噬細胞中MAP1LC3點下降，與免疫印跡結果一致。此外，flt4?LBD/?LBD BMDMs顯示出LAMP1與MAP1LC3共定位的百分比下降。這些數據表明，FLT可以促進吞噬-溶酶體的成熟(Figure 4G)。為進一步確定FLT4信號通路是否增強自噬溶酶體的形成，通過巴弗洛霉素a1處理Flt4WT/WT和Flt4?LBD/?LBD巨噬細胞來阻斷自噬溶酶體融合，然后轉染。結果發(fā)現，與flt4WT/WT巨噬細胞相比，flt4?LBD/?LBD巨噬細胞中SQSTM1/p62 蛋白水平表達量增加。這表明FLT4參與了自噬溶酶體形成的調控(Figure 4H)。

由于作者觀察到寒鏈球菌感染后，FLT4同時影響巨噬細胞的自噬和炎癥小體激活，作者進一步探索自噬是否可以調節(jié)炎癥小體激活。作者使用自噬抑制劑3-MA治療傷寒鏈球菌感染的巨噬細胞，結果發(fā)現寒鏈球菌在Flt4WT/WT巨噬細胞中的清除水平與在Flt4?LBD/?LBD巨噬細胞中的清除水平相似(Figure 4I)。此外，3-MA治療顯著增加了成熟IL1B的分泌(Figure 4J)，并且增加了CASP的裂解(Figure 4k)。此外，野生型和flt4?LBD/?LBD感染巨噬細胞后，3-MA處理可產生相當數量的胞內寒鏈球菌，同時也消除了成熟IL1B分泌、PYCARD寡聚和CASP1激活(Figure 4J-K）?？偟膩碚f，作者已經闡明了FLT4以自噬機制依賴的方式增強了細菌的消除并減弱了過度的炎癥小體激活。

Fig 4 FLT4以自噬依賴的方式增強細菌消除和防止炎性小體激活

5.     FLT4與AMPK相互作用以協(xié)調糖代謝重編程、自噬和炎癥小體激活

FLT4是細胞表面的一種酪氨酸激酶受體，研究其酪氨酸激酶活性如何對其靶向下游效應物調節(jié)自噬和炎癥小體激活的能力至關重要。為了識別新的結合部分，作者在RAW264.7細胞系中過表達FLT4，并進行質譜分析。作者根據它們潛在的酪氨酸修飾位點和與自噬的功能相關性確定了11個潛在的靶蛋白。采用免疫沉淀法確定FLT4和這些候選基因之間的相互作用，其中RKAA1 / AMPKα1(蛋白激酶,
amp激活，α 1催化亞基)與HEK293細胞中的FLT4相互免疫沉淀(Figure 5A)。此外，在RAW264.7細胞中，FLT4與PRKAA1對傷寒沙門氏菌感染的反應增強(Figure 5B)。沙門氏菌感染增強了PRKAA1磷酸化(p-PRKAA1)水平和MAP1LC3脂化(MAP1LC3-II)水平，這種效果通過Flt4抑制劑的治療顯著降低(Figure 5C)。相比之下，FLT4抑制劑未能進一步減弱FLT4?LBD/?LBD巨噬細胞的這些效應(Figure 5C)。

作者接下來評估了FLT4是否通過AMPK減少自噬。感染沙門氏菌后，flt4?LBD/?LBD巨噬細胞中p-PRKAA1、p-ULK1(Ser555)和MAP1LC3 脂化作用降低 (Figure 5D)。有趣的是，藥物AMPK激活劑AICAR(5-氨基酰亞胺-唑-4-carboxamide核糖核苷)治療顯著提高了flt4?LBD/?LBD巨噬細胞的p-ULK1、p-PRKAA1和MAP1LC3脂化水平，達到了與flt4 WT/WT巨噬細胞相似的程度(Figure 5D)。這表明激活的AMPK是FLT4信號通路調控自噬的下游效應因子。此外,敲低PRKAA1降低ULK1水平和UMAP1LC3脂化水平，以及flt4WT/WT和Flt4?LBD/?LBD巨噬細胞的MAP1LC3脂化程度，與感染后的Flt4 WT/WT和Flt4?LBD/?LBD巨噬細胞相似 (Figure 5E)。此外，使用AMPK激動劑AICAR顯著抑制成熟IL1B的產生，這表明AMPK抑制炎性小體激活(Figure 5F)。同樣的，AICAR 處理后，成熟Flt4WT/WT和Flt4?LBD/?LBD巨噬細胞中IL1B和胞內細胞內沙門氏菌感染情況接近(Figure 5F，G),這些數據表明AMPK是FLT4在炎癥小體激活和細胞內細菌自噬消除中的下游靶點。

由于作者觀察到AMPK激動劑可以逆轉flt4?LBD/?LBD巨噬細胞在調節(jié)自噬和炎癥小體激活中的表型，接下來進一步探討FLT4是否通過下游AMPK調控葡萄糖代謝。作者在感染時通過AMPK激活了flt4 WT/WT和flt4?LBD/?LBD巨噬細胞中的AMPK(Figure 5H)，靜息狀態(tài)下，flt4WT/WT和flt4?LBD/?LBD巨噬細胞顯示出相似的葡萄糖代謝產物。細菌感染后，與flt4WT/WT巨噬細胞相比，Flt4?LBD/?LBD巨噬細胞顯示NADH/NAD 和 NADPH/NADP 水平顯著降低。但提高乳酸和琥珀酸水平。這些數據共同表明，FLT4和AMPK在巨噬細胞中共同作用，重新編程糖酵解代謝，這與炎癥小體激活和自噬有關。

FIG 5.FLT4與AMPK相互作用以協(xié)調糖代謝重編程、自噬和炎癥小體激活

6.     flt4誘導的PRKAA1酪氨酸磷酸化對自噬和炎癥小體的激活是必不可少的

接下來，作者研究了PRKAA1中的哪些酪氨酸可以被酪氨酸激酶受體FLT4磷酸化。FLT4過表達促進了PRKAA1酪氨酸磷酸化(Figure 6A)。根據UniPort數據庫的質譜分析結果，作者確定了PRKAA1中5個可能的酪氨酸磷酸化位點，包括Y247 (A1)、Y294 (A2)、Y441/442 (A3)和Y500 (A5)，作者在每個位點進行了了苯丙氨酸點突變(Fig 6B)，并將它們分別轉染到Hela細胞。與野生型對照(A0)相比，A1和A3突變可顯著降低MAP1LC3脂化(Fig 6C,D)。作者進一步的通過PRKAA1突變過表達FLT4，發(fā)現A1和A3突變也顯著阻斷FLT4誘導MAP1LC3脂化(Fig 6D)。這些數據表明，Y247和Y441/442的磷酸化在PRKAA1在自噬中起著至關重要的作用。

為進一步確定PRKAA1酪氨酸在Y247和Y441/442位點磷酸化未知的功能，作者將野生型PRKAA1的 A1、A3突變穩(wěn)定表達到iBMDM中(Figure 6E)。在鼠傷寒桿菌感染后，A0 iBMDMs中PRKAA1和ULK1的磷酸化增加，而 A1或A3突變體的p-PRKAA1和p-ULK1水平顯著降低(Figure 6E）。與此一致的是，與GFP對照相比，PRKAA1過表達而非A1和A3突變體增強了細菌清除率(Figure 6G),

為了確定PRKAA1是否也能調節(jié)炎癥小體的激活，作者用鼠傷寒桿菌感染了表達PRKAA1或A1或A3突變體的iBMDM。作者發(fā)現PRKAA1過表達減少了成熟巨噬細胞產生IL1B，但A3突變體(Y441/442 F)未顯示抑制作用(Figure 6H).

FIG 6 flt4誘導的PRKAA1酪氨酸磷酸化對自噬和炎癥小體的激活是必不可少的

FIG 7 flt4-AMPK調節(jié)巨噬細胞糖酵解代謝，以協(xié)調細菌感染期間的自噬、焦亡和炎癥小體激活。

綜上所述，作者的首次發(fā)現提出flt 4磷酸化PRKAA1中的Y247和Y441/442對糖酵解重編程、細菌清除和炎癥小體激活至關重要(Figure 7)。

參考文獻：
Ma, L., et al., FLT4/VEGFR3 activates AMPK to coordinate glycometabolic reprogramming with autophagy and inflammasome activation for bacterial elimination. Autophagy, 2021: p. 1-16.