HMGA2通過腫瘤相關(guān)巨噬細胞招募促進結(jié)直腸癌進展
腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)通常表現(xiàn)為腫瘤前M2樣表型，通過其免疫抑制活性強烈影響結(jié)直腸癌(CRC)的進展。HMGA2是一種癌蛋白，在CRC細胞中異常過表達。然而，腫瘤來源的HMGA2調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境的機制尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)，在體外和體內(nèi)，癌細胞中的HMGA2促進巨噬細胞招募和M2極化。HMGA2直接與STAT3啟動子結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄，進而誘導(dǎo)CCL2分泌，從而促進巨噬細胞募集。腫瘤細胞中HMGA2的表達和間質(zhì)中CD68的表達之間存在很強的正相關(guān)。在所有患者或遠處轉(zhuǎn)移陰性的亞組中，CD68表達升高的患者的總生存期較差。我們的工作揭示了CRC中HMGA2/STAT3/CCL2軸和巨噬細胞招募之間的聯(lián)系。這些發(fā)現(xiàn)為靶向CRC中的HMGA2/STAT3/CCL2軸提供了一種新的治療選擇。本文于2022年1月發(fā)表于“Theranostics”（IF=11.556）。
技術(shù)路線
結(jié)果
1）在CRC細胞中敲除HMGA2可抑制TAM浸潤、M2極化和CCL2的分泌
利用CRISPR/Cas9技術(shù)，我們用特異性sgRNA在小鼠CRC細胞系(MC38和CT26)中產(chǎn)生了穩(wěn)定的Hmga2敲除(Hmga2- KO)細胞。Western blot分析驗證了敲除Hmga2的有效性(圖1A)。C57BL/6小鼠皮下接種對照或Hmga2-KO MC38細胞(MC38-NC和MC38-sgA2)，BALB/c小鼠皮下接種CT26-NC或CT26-sgA2細胞(圖1B)。結(jié)果顯示，sgRNA介導(dǎo)的敲除Hmga2在C57BL/6和BALB/c皮下腫瘤模型中均顯著抑制腫瘤生長(圖1C-D)。
M2巨噬細胞可以促進腫瘤的生長和發(fā)展。為了闡明Hmga2在TAM招募和極化中的作用，我們采用流式細胞術(shù)量化巨噬細胞(CD11b+F4/80+)和M2巨噬細胞(CD11b+F4/80+CD206+)的百分比。攜帶Hmga2敲除MC38腫瘤的小鼠，浸潤性CD11b+F4/80+巨噬細胞和CD11b+F4/80+CD206+ M2巨噬細胞減少(圖1E)，提示Hmga2敲除的抗腫瘤作用可能與CRC中TAMs的招募和極化有關(guān)。同樣，在Hmga2敲除CT26腫瘤的小鼠中也觀察到了類似的結(jié)果(圖1F)。這些結(jié)果表明，Hmga2在體內(nèi)促進TAM招募和M2極化。
CCL2是一種重要的趨化因子，有助于巨噬細胞招募和浸潤。為了探究CCL2是否受Hmga2調(diào)控，我們采用qPCR檢測CCL2的表達，ELISA檢測CCL2的分泌。如圖1G和1I所示，與對照組相比，MC38-sgA2細胞腫瘤中CCL2的表達減少，產(chǎn)生的CCL2減少。同樣，通過qPCR(圖1H)和ELISA檢測(圖1J)，在CT26皮下腫瘤模型中，Hmga2的缺失抑制了CCL2的表達和分泌。
接下來，為了探討TME中CRC細胞中Hmga2缺失與巨噬細胞極化之間的關(guān)系，我們評估了M1相關(guān)(TNF-α和IL-12b)和M2相關(guān)(TGF-β)細胞因子的表達。如圖1G-H所示，qPCR結(jié)果顯示，CRC細胞敲除Hmga2后，MC38和CT26異種移植瘤中TNF-α和IL-12b的表達均增加，TGF-β水平明顯降低。在MC38和CT26皮下腫瘤模型中，ELISA進一步證實Hmga2-KO腫瘤組織中TNF-α增加和TGF-β分泌減少(圖1I-J)?？偟膩碚f，在CRC細胞中敲除Hmga2可以抑制TAM浸潤、M2極化和CCL2的分泌。
2）在AOM/DSS模型中，HMGA2腸上皮特異性敲入促進TAM浸潤、M2極化和CCL2分泌
我們試圖了解在CRC腫瘤發(fā)生過程中，Hmga2的腸上皮特異性敲入(KI)在TAM浸潤和M2極化中的參與。我們使用WT和腸上皮特異性Hmga2 KI小鼠，隨后用AOM和DSS治療誘導(dǎo)結(jié)直腸腫瘤(圖2A)。如圖2B所示，Hmga2 KI小鼠比WT小鼠在腸道內(nèi)發(fā)生的腫瘤更多。與WT小鼠相比，在給藥AOM/DSS后，Hmga2 KI小鼠腸道組織中CD11b+F4/80+巨噬細胞和CD11b+F4/80+CD206+ M2巨噬細胞的比例增加(圖2C)。此外，通過qPCR和ELISA檢測介導(dǎo)巨噬細胞浸潤的趨化因子CCL2水平(圖2D-E)。我們發(fā)現(xiàn)Hmga2 KI可顯著上調(diào)小鼠腸道組織中CCL2的產(chǎn)生。qPCR結(jié)果顯示，AOM/DSS處理后，Hmga2 KI小鼠腸道組織中M1細胞因子(TNF-α)的表達顯著降低，M2細胞因子(TGF-β)的表達顯著增加(圖2D)。這些結(jié)果經(jīng)ELISA證實(圖2E)。綜上所述，腸道上皮特異性Hmga2 KI通過促進TAM浸潤、M2極化和CCL2分泌來調(diào)節(jié)TME。
3）HMGA2促進體外巨噬細胞招募、M2極化和CCL2分泌
為了進一步說明HMGA2在體外是否有助于TAM招募，我們利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)。如圖3A所示，PMA分化的THP1人單核細胞與HMGA2過表達或不表達的HT29人結(jié)直腸癌細胞(HT29-NC和HT29-A2)共培養(yǎng)，RAW264.7細胞與HMGA2敲除或不敲除的CT26小鼠結(jié)直腸癌細胞(CT26-NC和CT26-sgA2)。有趣的是，THP1與HT29-A2共培養(yǎng)比HT29-NC細胞表現(xiàn)出更高的遷移能力(圖3B)。相反，與CT26-sgA2細胞共培養(yǎng)時，RAW264.7的遷移能力顯著減弱(圖3C)。隨后，我們通過qPCR檢測CRC細胞中CCL2的表達水平，發(fā)現(xiàn)HMGA2過表達會上調(diào)HT29細胞中CCL2的表達(圖3D)，而HMGA2 KO會下調(diào)CT26細胞中CCL2的表達(圖3E)。此外，HT29-A2條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的THP1細胞中TNF-α的表達下降，而TGF-β則呈現(xiàn)相反的趨勢(圖3D)。與對照組相比，CT26-sgA2條件培養(yǎng)基處理RAW264.7細胞后，TNF-α水平升高，TGF-β水平降低(圖3E)。這些研究進一步證實HMGA2在體外促進巨噬細胞招募、M2極化和CCL2分泌。
既往研究表明，STAT3在腫瘤免疫耐受中起關(guān)鍵作用。為了研究HMGA2是否通過STAT3依賴機制調(diào)控TME中TAMs的免疫抑制，我們分析了CRC中HMGA2與STAT3的關(guān)系。如圖4A所示，shRNA介導(dǎo)的Hmga2敲低導(dǎo)致MC38和CT26細胞中總和磷酸化的Stat3 (pStat3Tyr705)蛋白水平下降。Western blotting結(jié)果顯示，sgRNA介導(dǎo)的敲除Hmga2顯著抑制了MC38和CT26細胞中Stat3和pStat3Tyr705的表達(圖4B)。相反，與對照組相比，Hmga2過表達的LoVo和HT29細胞中STAT3和pSTAT3Tyr705的表達上調(diào)(圖4C)。此外，我們將對照或過表達Hmga2的載體轉(zhuǎn)染到對照或Hmga2缺失的CT26細胞中(CT26-NC、CT26-sgA2、CT26- sgA2 +NC和CT26-sgA2 +A2)。如圖4D所示，Hmga2過表達恢復(fù)后，敲除Hmga2后減少的Stat3和pStat3Tyr705的表達量逆轉(zhuǎn)。為了更好地了解Hmga2和Stat3在體內(nèi)的調(diào)控機制，我們通過Western blotting檢測了在WT和KI小鼠腸道組織中Stat3、pStat3Tyr705和Hmga2的表達。如圖4E所示，我們發(fā)現(xiàn)Hmga2的敲入提高了Stat3和pStat3Tyr705的水平。
為了確定HMGA2是否能在轉(zhuǎn)錄水平激活STAT3，我們進行了熒光素酶和ChIP檢測。如圖4F所示，我們將5個人類STAT3啟動子片段克隆到pGL3載體上，分別為-139/+133、-1555/-140、-850/-140、-1555/-851和-1555/+133。結(jié)果顯示，HMGA2過表達顯著刺激了STAT3啟動子區(qū)域-1555/-140、-850/-140、-1555/-851和-1555/+133的熒光素酶活性，說明-1555/-140片段可能參與了HMGA2調(diào)控STAT3轉(zhuǎn)錄的過程(圖4F)。為了進一步證實，我們采用ChIP實驗驗證了其直接調(diào)控機制，并確定了結(jié)合位點的位置。如圖4G所示，HMGA2直接與STAT3啟動子結(jié)合，且HMGA2結(jié)合位點主要位于-815至-546之間的STAT3啟動子區(qū)域。接下來，我們分別突變了STAT3啟動子段側(cè)翼的三個Hmga2結(jié)合位點(-815/-546)。圖4H顯示的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染含有突變1(-743/-730，從TAATTACTCTATTT到TAGCCACTCTACGT)和突變3(-585/-576，從TATCTAACTA到TCTCGCTA)的結(jié)構(gòu)體后，熒光素酶的誘導(dǎo)活性顯著減弱。這些結(jié)果表明，HMGA2通過直接結(jié)合STAT3的-743/-730和-585/-576啟動子區(qū)域，增強了STAT3的轉(zhuǎn)錄。
5）CRC細胞中HMGA2過表達增強CCL2表達和巨噬細胞遷移增加依賴于STAT3
我們通過IL6處理CT26-NC和CT26-sgA2細胞，刺激Stat3，然后與RAW264.7細胞共培養(yǎng)，確定Hmga2是否以Stat3依賴的方式調(diào)控CCL2的表達。IL6處理導(dǎo)致pStat3Tyr705表達增加(圖5A)， CRC細胞中CCL2表達強烈上調(diào)(圖5B)， RAW264.7細胞遷移增強(圖5C)。此外，將靶向STAT3的siRNA引入LoVo-NC和LoVo-A2細胞，通過Western blotting評價STAT3抑制效果(圖5D)。我們觀察到，在LoVo-NC細胞中，siSTAT3組CCL2的表達低于對照組，說明STAT3上調(diào)了CCL2的表達(圖5E)。我們還發(fā)現(xiàn)HMGA2過表達導(dǎo)致CCL2的表達增加，但引入靶向STAT3的siRNA后，CCL2的誘導(dǎo)被取消(圖5E)。在Transwell共培養(yǎng)體系中觀察到一致的結(jié)果。LoVo細胞中STAT3沉默導(dǎo)致THP1細胞遷移減少(圖5F)。與LoVo-NC細胞共培養(yǎng)相比，THP1細胞與LoVo-A2細胞共培養(yǎng)顯示出更強的遷移能力，但通過引入STAT3 siRNA，這種增加的遷移被消除(圖5F)。這些結(jié)果表明，HMGA2上調(diào)了CRC細胞中CCL2的表達，并以Stat3依賴的方式促進巨噬細胞的遷移。
6）CRC細胞中HMGA2過表達導(dǎo)致巨噬細胞遷移的增加依賴于CCL2
為了研究CCL2在巨噬細胞招募中的作用，我們用重組小鼠CCL2處理CT26-NC和CT26-sgA2細胞，然后與RAW264.7細胞共培養(yǎng)。敲除Hmga2抑制了RAW264.7細胞的遷移潛能，而重組CCL2蛋白處理增強了其遷移潛能(圖6A)。此外，我們用中和性抗CCL2抗體預(yù)孵育LoVo細胞，然后使用Transwell共培養(yǎng)體系評估THP1細胞的遷移能力。如圖6B所示，我們的結(jié)果表明，HMGA2過表達促進THP1細胞的遷移，而抗CCL2抗體的處理則使THP1細胞遷移消失，說明HMGA2和CCL2在巨噬細胞招募中起著至關(guān)重要的作用。我們還發(fā)現(xiàn)，中和CCL2后，與LoVo-A2共培養(yǎng)的THP1遷移誘導(dǎo)被取消。這些數(shù)據(jù)表明，HMGA2過表達以CCL2依賴的方式促進巨噬細胞的遷移。
7）人結(jié)直腸癌標(biāo)本中HMGA2和CD68表達的臨床意義
有報道稱CD68是巨噬細胞的免疫組化染色標(biāo)記物。為了研究HMGA2水平與CRC患者巨噬細胞浸潤的關(guān)系，我們采用免疫組化染色對167例人類CRC標(biāo)本中HMGA2和CD68的表達進行了評估。結(jié)果表明，腫瘤細胞中HMGA2的表達與間質(zhì)中CD68的表達有很強的相關(guān)性。如圖7A-B所示，我們發(fā)現(xiàn)HMGA2與CD68表達呈正相關(guān)趨勢。接下來，我們進行Kaplan-Meier生存分析來評估CD68作為CRC預(yù)后標(biāo)志物的潛在價值。如圖7C所示，在所有患者中，間質(zhì)中CD68高表達與患者生存期降低相關(guān)。當(dāng)分層到遠處轉(zhuǎn)移陽性和陰性亞組時，我們發(fā)現(xiàn)CD68高表達患者的總生存期較差，而CD68低表達患者的總生存期較好(圖7D)。這些結(jié)果提示間質(zhì)CD68可作為臨床預(yù)后的標(biāo)志和預(yù)測因子，提示其在結(jié)直腸癌中的臨床意義。
結(jié)論：CRC細胞中過表達HMGA2通過上調(diào)Sat3介導(dǎo)的CCL2分泌，促進巨噬細胞招募和M2極化，從而促進CRC腫瘤免疫抑制。我們的研究揭示了HMGA2在免疫抑制微環(huán)境形成中的一種新的促癌作用。
參考文獻：
Xin Wang, Jian Wang, Jiahui Zhao, Hao Wang, Jing Chen, Jingjing Wu. HMGA2 facilitates colorectal cancer progression via STAT3-mediated tumor-associated macrophage recruitment. Theranostics 2022; 12(2): 963-975. doi:10.7150/thno.65411.