環(huán)狀RNA circHERC4作為一種新的致癌驅(qū)動(dòng)因子,通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin軸促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2022-03-09
目前有研究表明CircHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin通路在促進(jìn)腫瘤侵襲性中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是疾病的預(yù)后......


結(jié)直腸癌(CRC)患者死亡的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)表明,circRNA在癌癥的起始和發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而,circRNAs協(xié)同癌癥轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制仍不明確,需要進(jìn)一步澄清。因此,目前有研究表明CircHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin通路在促進(jìn)腫瘤侵襲性中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是疾病的預(yù)后生物標(biāo)志物,證明CircHERC4可作為CRC患者的一個(gè)可開發(fā)的治療靶點(diǎn)。該研究發(fā)表在《Journal of HematologyOncology》,IF: 17.388。


技術(shù)路線:


主要研究結(jié)果:

1. 結(jié)腸癌中circHERC4的識(shí)別和特征

作者選擇結(jié)腸癌組織和配對(duì)的相鄰非腫瘤組織進(jìn)行RNA序列分析,以獲得CircRNA的表達(dá)譜。根據(jù)fold change 10.0 P< 0.05,篩選了轉(zhuǎn)移相關(guān)的CircRNA,最后應(yīng)用transwell侵襲試驗(yàn)篩選出功能性CircRNA,最終篩選出circHERC4has_circ_0007113)(圖1a)。通過RNase R和放線菌素D處理后,HERC4 mRNA水平顯著下調(diào),而circHERC4 mRNA水平保持不變(1c, d)。此外,通過核質(zhì)分離后的qRT-PCR,發(fā)現(xiàn)circHERC4主要位于細(xì)胞質(zhì)中(1e)。

1 circHERC4CRC細(xì)胞中的鑒定和表征


2.
circHERC4而非HERC4 mRNA的過度表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)

qRT-PCR檢測120對(duì)組織樣本(120個(gè)癌組織和120個(gè)正常組織)中circHERC4的表達(dá)。結(jié)果表明,在結(jié)腸癌患者中,circHERC4的表達(dá)顯著增加(P<0.001)(圖2a)。circHERC4的高表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移(P<0.01)(圖2b)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(主要是肝轉(zhuǎn)移)呈正相關(guān)(P<0.01)(圖2c)。對(duì)具有臨床特征的120例結(jié)腸癌患者進(jìn)行相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)circHERC4表達(dá)與病理分期和組織學(xué)分級(jí)相關(guān)(表1)。circHERC4的過度表達(dá)與結(jié)腸癌中宿主HERC4mRNA無關(guān)(圖2d)。Kaplan-Meier生存分析顯示,circHERC4高表達(dá)的患者總體生存率較低(P<0.05)(圖2g)。HERC4 mRNA表達(dá)水平與患者預(yù)后無關(guān)(圖2h)。綜上所述,這些結(jié)果表明,circHERC4(而非其宿主HERC4 mRNA)CRC組織中顯著上調(diào),而更高的circHERC4表達(dá)可能意味著預(yù)后不良。

2 CircHERC4CRC組織中過表達(dá)并與轉(zhuǎn)移相關(guān)

1 circHERC4低表達(dá)和高表達(dá)的CRC患者的臨床特點(diǎn)


3.
CircHERC4作為一種致癌基因,在體外和體內(nèi)促進(jìn)CRC的增殖、遷移和侵襲

為了確定circHERC4的功能作用,檢測了circHERC4在人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞、HCoEpicCRC細(xì)胞(HCT116、DLD-1HT29、LoVoSW480)中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circHERC4CRC細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào),其中與HCoEpic細(xì)胞相比,circHERC4DLD-1HCT116細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較高,而在SW480細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較低(3a)。因此,選擇HCT116、DLD-1SW480細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步研究。首先設(shè)計(jì)了針對(duì)circHERC4剪接序列的siRNAs(3b)。DLD-1HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染circHERC4 siRNA,其成功沉默circHERC4,但未沉默HERC4 mRNA(圖3c)。根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn),沉默circHERC4顯著抑制了DLD-1HCT116細(xì)胞的活力(3d)。集落形成實(shí)驗(yàn)顯示,與NC相比,circHERC4下調(diào)組的DLD-1HCT116細(xì)胞增殖能力也受到抑制(3e)。此外,transwell實(shí)驗(yàn)顯示,沉默circHERC4抑制了DLD-1HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力(3f)。過表達(dá)circHERC4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)circHERC4明顯增加(3g)。結(jié)果表明,circHERC4過表達(dá)顯著促進(jìn)了體外CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(3h-j)。

異種移植和轉(zhuǎn)移小鼠模型也支持circHERC4在體內(nèi)發(fā)揮致癌作用的觀點(diǎn)。干擾circHERC抑制腫瘤的生長速度和腫瘤重量 (3k-m)。與陰性對(duì)照組相比,sh-circHERC4組肺、肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率顯著降低(3n)HE染色顯示sh-NC組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)面積極高,而sh-circHERC4組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)面積顯著降低(3o)。以上數(shù)據(jù)證實(shí)了circHERC4在體外和體內(nèi)均能促進(jìn)CRC的進(jìn)展,特別是轉(zhuǎn)移。

3 CircHERC4作為一種致癌基因,在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)增殖、遷移和侵襲


4.
CircHERC4CRC細(xì)胞中直接與miR-556-5p結(jié)合

在雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中,miR-556-5p具有最大的熒光素酶活性抑制作用(4a)。RNA pull-down實(shí)驗(yàn)后的qPCR結(jié)果顯示,circHERC4 mRNA顯著富集,而宿主HERC4 mRNA則不顯著富集。通過qPCR檢測circHERC4 pull-down部分中所有具有熒光素酶活性抑制作用的7個(gè)miRNA。circHERC4 pull-down部分中miR-556-5p的富集顯著高于NC組和其他miRNAs(4b)。這些結(jié)果提示miR-556-5p直接與circHERC4結(jié)合,并可能參與了circHERC4CRC中的功能。


4 CircHERC4通過與miR-556-5p相互作用促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲


5.
抑制miR-5565p可介導(dǎo)circHERC4的致癌功能,激活CRC中的Notch信號(hào)通路

qPCR檢測證實(shí)了miR-556-5pCRC組織中下調(diào)(4c),miR-556-5p在有淋巴轉(zhuǎn)移(4d)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(4e)患者中的表達(dá)水平要低得多。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者miR-556-5p水平較低,而其他特征與miR-556-5p的表達(dá)無顯著相關(guān)性(2)。miR-556-5p能顯著抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(4f-h)。拯救實(shí)驗(yàn)中miR-556-5p模擬物可以部分恢復(fù)過表達(dá)circHERC4增強(qiáng)的SW480細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(4i-k)。綜上所示,這些結(jié)果提供了證據(jù),表明miR-556-5p具有抗癌作用,并通過直接結(jié)合CRC部分介導(dǎo)circHERC4的致癌功能。

根據(jù)維恩圖(5a),篩選出了9109個(gè)在circHERC4沉默和miR-556-5p過表達(dá)的DLD-1細(xì)胞中顯著改變的轉(zhuǎn)錄本。KEGG通路富集分析顯示,這9109個(gè)轉(zhuǎn)錄本富集在許多腫瘤相關(guān)信號(hào)通路中,尤其是與結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)的Notch信號(hào)通路(5b)。因此, circHERC4可能通過激活Notch信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移,而Notch信號(hào)通路可能被miR-556-5p阻斷。

5 CTBP2miR-556-5p的靶基因


6.
CTBP2miR-556-5p的靶點(diǎn),通過抑制E-cadherin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)而發(fā)揮致癌作用

熱圖顯示Notch信號(hào)通路中大部分基因通過沉默circHERC4和過表達(dá)miR-556-5p而下調(diào)(5c)。結(jié)合生物信息學(xué)分析,CTBP2被預(yù)測為miR-556-5p的靶點(diǎn)(5d)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明miR-556-5p的過表達(dá)顯著降低了包括CTBP2野生型結(jié)合位點(diǎn)而不包括突變型結(jié)合位點(diǎn)的載體的熒光素酶活性(5d)。Western blot實(shí)驗(yàn)證明,miR-556-5p可以顯著抑制CTBP2的蛋白水平,但卻挽救了CTBP2靶向E-cadherin的表達(dá)(5e)

GEPIA數(shù)據(jù)庫和免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTBP2蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平較癌旁正常組織上調(diào)(6a,b)。Kaplan Meier生存分析評(píng)估CTBP2高表達(dá)與CRC患者較低的生存概率顯著相關(guān)(6c)。敲除CTBP2促進(jìn)E-cadherin蛋白表達(dá)水平下降(6d)。與NC相比,沉默CTBP2顯著抑制了細(xì)胞增殖 (6e-g),這些結(jié)果為CTBP2miR-556-5p的靶基因,其過表達(dá)通過抑制E-cadherin介導(dǎo)CRC腫瘤轉(zhuǎn)移提供了重要的認(rèn)識(shí)。

6 CTBP2CRC組織中過表達(dá),可促進(jìn)CRC細(xì)胞的進(jìn)展


7.
沉默CTBP2可以消除過度表達(dá)circHERC4所引起的效應(yīng)

當(dāng)circHERC4被敲低時(shí),CTBP2蛋白水平顯著下降。相反,CTBP2的下游靶蛋白E-cadherin在這些條件下顯著增加(6h),Ki-67circHERC4沉默后急劇下調(diào)(6i)。挽救實(shí)驗(yàn)來研究circHERC4CTBP2之間的功能相互作用。與轉(zhuǎn)染空載體或siNC模擬物的SW480細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染CTBP2 siRNA模擬物的過表達(dá)circHERC4細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯下降(6j-l),circHERC4的致癌功能可以通過消除CTBP2的表達(dá)而部分逆轉(zhuǎn)。Western blotting結(jié)果顯示,CTBP2可以部分恢復(fù)circHERC4對(duì)E-cadherin表達(dá)的影響(6m)circHERC4CTBP2在高級(jí)別CRC組織中過表達(dá),而miR-556-5p在低級(jí)別CRC組織中更豐富(7a)。異種皮下移植的結(jié)果表明,circHERC4過表達(dá)可加速腫瘤生長,注射CTBP2 siRNAmiR-556-5p mimic后,這種作用可被抑制(7b-d)。免疫組化實(shí)驗(yàn)表明,沉默CTBP2或過表達(dá)miR-556-5p來部分挽救circHERC4對(duì)CTBP2 Ki67促進(jìn)、E-cadherin抑制的作用。在尾靜脈注射小鼠模型中,上調(diào)circHERC4可促進(jìn)肺和肝臟轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的形成,當(dāng)CTBP2下調(diào)或miR-556-5p上調(diào)時(shí),circHERC4誘導(dǎo)的致癌作用被阻斷(7f-g)。總的來說,這些結(jié)果證明CTBP2可以促進(jìn)CRC的進(jìn)展,并且在體內(nèi)和體外都受到circHERC4/miR-556-5p軸的調(diào)控。

7 CTBP2circHERC4/miR-556-5p相互作用的調(diào)控


研究結(jié)論:

綜上所述,該報(bào)告發(fā)現(xiàn)了一個(gè)之前未被發(fā)現(xiàn)的致癌驅(qū)動(dòng)因子circHERC4CRC組織中升高,并與CRC的增殖、遷移和侵襲相關(guān)。此外,circHERC4CRC患者中的高表達(dá)與轉(zhuǎn)移和較差的生存率呈正相關(guān)。作者提出了circHERC4可以阻斷miR-556-5p對(duì)CTBP2的抑制活性的機(jī)制。因此,沉默circHERC4可以下調(diào)CTBP2的表達(dá),并伴隨E-cadherin的激活。該研究結(jié)果表明,circHERC4可能是一種潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物,沉默circHERC4CRC治療提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)(8)

8 circHERC4通過miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin信號(hào)通路促進(jìn)CRC發(fā)病和轉(zhuǎn)移的機(jī)制示意圖


參考文獻(xiàn):

He J, Chu Z, Lai W, et al. Circular RNA circHERC4 as a novel oncogenic driver to promote tumor metastasis via the miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin axis in colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021; 14(1):194.