化療后存活的癌細(xì)胞更易衰老和轉(zhuǎn)移？
轉(zhuǎn)移是鼻咽癌（NPC）治療失敗的主要原因。作者的III期臨床試驗(yàn)顯示吉西他濱和順鉑誘導(dǎo)化療可以消除局部區(qū)域晚期鼻咽癌患者的微轉(zhuǎn)移并延長(zhǎng)生存期。然而，化療耐藥患者屈服于轉(zhuǎn)移，確切的潛在機(jī)制尚不清楚。新的研究表明，化療引起的DNA損傷不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性死亡，還會(huì)引發(fā)原代細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞衰老。衰老是一種多方面的狀態(tài)，細(xì)胞在這種狀態(tài)下細(xì)胞周期停滯，并對(duì)腫瘤的發(fā)展起抑制或促進(jìn)作用。最近的發(fā)現(xiàn)表明，化療誘導(dǎo)的衰老可通過(guò)腫瘤細(xì)胞獲得的衰老相關(guān)分泌表型（SASP）的有害作用促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，抑制SASP的有害作用可能有助于預(yù)防化療后衰老腫瘤的轉(zhuǎn)移。
促炎細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子的分泌是SASP的主要特征。核因子κB（NF-κB）是參與SASP生成的關(guān)鍵分子模塊。累積的基因組研究報(bào)道，在鼻咽癌中，身體變化和EB病毒（EBV）協(xié)同維持炎性NF-κB激活。然而，個(gè)體NPC患者的軀體變異率相對(duì)較低，維持組成型NF-κB激活的內(nèi)源性分子尚不清楚。環(huán)狀RNA（circRNAs）的特征在于它們的結(jié)構(gòu)共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，并且在真核生物中廣泛存在。它們已被證明在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)。最近的研究表明，circRNAs在NF-κB信號(hào)調(diào)控中起著重要作用。然而，有關(guān)circRNAs參與鼻咽癌中SASP相關(guān)的NF-κB活化的研究尚不清楚。
在這項(xiàng)研究中，利用全球表達(dá)譜，作者確定了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中與衰老相關(guān)的表型，并將CircWDR37作為關(guān)鍵的參與調(diào)節(jié)因子。CircWDR37基因缺失使鼻咽癌細(xì)胞對(duì)化療誘導(dǎo)的衰老敏感，但抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移。在機(jī)制上，CircWDR37與雙鏈核糖核酸激活的蛋白激酶R相互作用，促進(jìn)其同源二聚化和磷酸化，并激活NF-κB信號(hào)，誘導(dǎo)SASP組分基因轉(zhuǎn)錄。臨床上，CircWDR37低表達(dá)的鼻咽癌患者可從誘導(dǎo)化療中獲益。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)揭示了化療誘導(dǎo)衰老和轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，并為鼻咽癌提供了有前景的治療靶點(diǎn)。本文于2023年3月發(fā)表在《Advanced Science》IF: 15.1期刊上。
主要技術(shù)路線
1、鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的衰老相關(guān)表型特征
為了探索衰老對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的貢獻(xiàn)，作者重新分析了作者先前發(fā)表的微陣列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)來(lái)自局部區(qū)域晚期鼻咽癌組織（n=24）和沒(méi)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（n=24）的根治性化療后的鼻咽癌組織?；蚣瘽饪s分析（GSEA）顯示，在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中，衰老和SASP相關(guān)信號(hào)顯著豐富（圖1a）。在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的137個(gè)鼻咽癌組織中差異表達(dá)的mRNAs中（圖1a），有22個(gè)與衰老和SASP相關(guān)，其中90.9%在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者中顯著上調(diào)（圖1b）。上調(diào)的SASP信號(hào)包括那些編碼生長(zhǎng)因子和趨化因子的信號(hào)，如C-X-C基序趨化因子配體10（cxcl 10；倍數(shù)變化= 1.92847，p = 0.02894）和C-X-C基序趨化因子配體16（cxcl 16；倍數(shù)變化= 1.80415，p = 0.00187）?；?2個(gè)信號(hào)表達(dá)的主成分分析（PCA）揭示了有和沒(méi)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NPC患者之間的區(qū)別。
為了驗(yàn)證NPC轉(zhuǎn)移的表達(dá)模式，作者采用了一對(duì)具有高（S18）和低（S26）轉(zhuǎn)移能力的NPC細(xì)胞模型進(jìn)行微陣列表達(dá)譜分析。正如預(yù)期的那樣，S18 NPC細(xì)胞顯示出類似的衰老相關(guān)和SASP相關(guān)信號(hào)豐度的表達(dá)改變（圖1b）。綜上所述，這些結(jié)果表明患有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NPC患者表現(xiàn)出衰老特征，并且參與衰老的基因可能有助于NPC轉(zhuǎn)移。
2、CircWDR37是NPC衰老和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子
新的證據(jù)表明，circRNAs通過(guò)直接或間接調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在腫瘤進(jìn)展和治療耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了研究circRNA是否參與鼻咽癌的衰老相關(guān)轉(zhuǎn)移，作者分析了S18和S26細(xì)胞系中circRNA的表達(dá)譜。在高轉(zhuǎn)移潛能的S18細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的56個(gè)CircRNA中，有48個(gè)在CircBase數(shù)據(jù)庫(kù)中被注釋，40個(gè)在腫瘤特異性CircRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（CSCD）中通過(guò)4種不同的算法進(jìn)一步驗(yàn)證。值得注意的是，hSA_CIRC_0000206，被稱為CircWDR37，在CircRNA候選序列中顯示了最高的CircRNA/宿主線性mRNA表達(dá)比率，這表明CircWDR37相對(duì)于其線性WDR37mRNA的表達(dá)水平較高（圖1c）。
CircWDR37是WDR37基因第6-9外顯子的頭部到尾部剪接；Sanger測(cè)序證實(shí)了連接位置（圖1D）。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證circWDR37在鼻咽癌細(xì)胞（S18、S26、HONE1和HK1）中的表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，與低轉(zhuǎn)移能力的S26細(xì)胞相比，circWDR37在高轉(zhuǎn)移能力的S18細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)（p < 0.05，圖1e）。使用反向轉(zhuǎn)錄的隨機(jī)引物，circWDR37可以在cDNA中用不同的引物擴(kuò)增，但不能在相應(yīng)的基因組DNA中擴(kuò)增（圖1f）。經(jīng)Dactinomycin處理后，CircWDR37表達(dá)的半衰期明顯長(zhǎng)于線性WDR37表達(dá)的半衰期（p<0.05，圖1g；圖S1d，支持信息）。對(duì)RNase R消化的抗性進(jìn)一步證實(shí)了CircWDR37的閉環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1h）。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分離以及熒光原位雜交（FISH）分析表明，circWDR37主要定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖1i，j）。這些數(shù)據(jù)表明circWDR37在具有高轉(zhuǎn)移潛力的鼻咽癌細(xì)胞中是一個(gè)真正上調(diào)的circRNA。
為了研究CircWDR37的功能，作者首先設(shè)計(jì)了針對(duì)CircWDR37的反向剪接位點(diǎn)的短干擾RNA（SiRNA），在不改變線性WDR37 mRNA表達(dá)的情況下特異性地下調(diào)CircWDR37的表達(dá)（p<0.05）。然后進(jìn)行RNA測(cè)序（RNA-seq）分析，檢測(cè)circWDR37敲低和不敲低的S18細(xì)胞的表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circWDR37敲低后，S18細(xì)胞中有267個(gè)基因上調(diào)，256個(gè)基因下調(diào)。GSEA分析顯示，circWDR37表達(dá)后，與轉(zhuǎn)移、SASP和鼻咽癌相關(guān)的基因特征顯著富集（FDR < 0.05，圖1k）。此外，KEGG分析表明，細(xì)胞衰老途徑中差異表達(dá)基因顯著富集（圖1l）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明circWDR37是與鼻咽癌衰老和轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵circRNA。
圖1 CircWDR37是NPC衰老和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子
3、circWDR37缺陷抑制化療誘導(dǎo)的鼻咽癌衰老細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移
為了驗(yàn)證circWDR37在NPC中的功能，作者進(jìn)行了體外Transwell和衰老實(shí)驗(yàn)。與GSEA結(jié)果一致，與相應(yīng)的對(duì)照相比，circWDR37敲低顯著抑制了NPC細(xì)胞系的遷移和侵襲能力（p < 0.05，圖2a），而circWDR37過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)了這些表型（p < 0.05）。接下來(lái)，作者試圖確定circWDR37是否影響衰老細(xì)胞的遷移和侵襲性。由于順鉑和吉西他濱是NPC的標(biāo)準(zhǔn)化療方案并且能夠誘導(dǎo)衰老，作者用順鉑或吉西他濱處理鼻咽癌細(xì)胞以誘導(dǎo)衰老，并進(jìn)行β半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色，這是一種標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞衰老標(biāo)記。結(jié)果顯示circWDR37缺失顯著降低了用順鉑或吉西他濱治療的NPC細(xì)胞中的細(xì)胞生長(zhǎng)（p < 0.05，圖2b）并增加了SA-β-gal的表達(dá)（圖2c）。此外，在用順鉑和吉西他濱治療的NPC細(xì)胞中，circWDR37敲除顯著增強(qiáng)了p16INK4a（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2a，CDKN2A）的表達(dá)，p16INK4A是細(xì)胞衰老的最具代表性的標(biāo)志（圖2d）。總之，這些數(shù)據(jù)表明circWDR37下調(diào)增強(qiáng)了NPC順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。
盡管最近的研究表明化療誘導(dǎo)的衰老通過(guò)SASP促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，但作者驚訝地發(fā)現(xiàn)，在順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)衰老后，circWDR37敲低顯著抑制了NPC細(xì)胞的遷移和侵襲能力（p < 0.05，圖2e）?？傊@些數(shù)據(jù)表明circWDR37缺陷促進(jìn)了化療誘導(dǎo)的衰老，但削弱了衰老NPC細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移能力。
圖2 CircWDR37缺陷抑制化療誘導(dǎo)的衰老NPC細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移
4、CircWDR37刺激NF-κB激活以促進(jìn)化療誘導(dǎo)的促炎SASP基因轉(zhuǎn)錄
接下來(lái)作者闡明了circWDR37調(diào)節(jié)NPC衰老和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。RNA-seq轉(zhuǎn)錄組圖譜的GSEA顯示，與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的基因集與circWDR37表達(dá)顯著正相關(guān)（FDR < 0.05，圖3a）。發(fā)現(xiàn)circWDR37敲低后，一組18個(gè)NF-κB靶基因在NPC細(xì)胞中下調(diào)。RT-qPCR 分析驗(yàn)證，與siSCR對(duì)照相比，circWDR37敲低顯著降低了HONE1、S18和HK1細(xì)胞中10個(gè)NF-κB靶基因的表達(dá)（p < 0.05，圖3b）。雙熒光素酶測(cè)定證實(shí)，circWDR37缺失顯著抑制NPC細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性（p < 0.05，圖3c）。
上述下調(diào)的基因包括多種細(xì)胞因子和趨化因子編碼基因，例如白細(xì)胞介素1α（IL1A）、白細(xì)胞介素1β（IL1β）、白細(xì)胞介素8（IL8，也稱為CXCL8）和C-C基序趨化因子配體20（CCL20），都是關(guān)鍵的促炎SASP因子。考慮到SASP是衰老最重要的特征，對(duì)于衰老促進(jìn)轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，作者進(jìn)一步評(píng)估了circWDR37是否影響化療誘導(dǎo)后的SASP。結(jié)果表明，circWDR37缺陷確實(shí)顯著抑制了順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)的SASP獲得，如IL1A、IL1B、IL8和CCL20豐度降低所示（圖3d）。作者還注意到，在敲除circWDR37的NPC細(xì)胞中，化療后NF-κB靶基因Cyclin D1（CCND1）的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平上均顯著降低（圖3d，e）。CCND1是一種p16抑制劑，可激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6），通過(guò)G1/S期檢查點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展以克服細(xì)胞周期停滯，這可能解釋了circWDR37缺陷通過(guò)下調(diào)Cyclin D1表達(dá)使NPC細(xì)胞對(duì)順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)的衰老敏感的機(jī)制。這些結(jié)果表明circWDR37缺失抑制化療誘導(dǎo)的促炎性SASP。
I-kappaB激酶α/β（IKKα/β）、NF-κB抑制因子α（IκBβ）和RELA（又稱p65）的磷酸化是經(jīng)典的NF-κB信號(hào)激活的關(guān)鍵步驟。作者發(fā)現(xiàn)，CircWDR37基因敲除顯著抑制了IKKα/β、IκBβ和p65的磷酸化，而不影響它們的總蛋白表達(dá)（圖3f），而CircWDR37過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)了它們的磷酸化。核因子NF-κB p50/p65異源二聚體的磷酸化和移位有助于靶基因的轉(zhuǎn)錄。作者發(fā)現(xiàn)，CircWDR37基因敲除后，磷酸化p65的核位置顯著減少（圖3G），而CircWDR37過(guò)表達(dá)則起到相反的作用。免疫熒光試驗(yàn)也證實(shí)了circWDR37敲除后p65的核轉(zhuǎn)位減少（p < 0.05，圖3h）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明circWDR37激活NF-κB信號(hào)以促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞中化療誘導(dǎo)的促炎性SASP成分基因轉(zhuǎn)錄。
圖3 CircWDR37刺激NF-κB介導(dǎo)的化療誘導(dǎo)的促炎性SASP基因轉(zhuǎn)錄
5、CircWDR37誘導(dǎo)PKR同二聚化和磷酸化
為了研究circWDR37激活NF-κB途徑的機(jī)制，作者使用生物素標(biāo)記的體外轉(zhuǎn)錄的circWDR37進(jìn)行了RNA pull-down分析，然后進(jìn)行了質(zhì)譜分析。在pull-down的蛋白質(zhì)中，circWDR37被發(fā)現(xiàn)與雙鏈RNA激活的蛋白激酶R（PKR）相互作用，PKR是一種與NF-κB激活相關(guān)的雙鏈RNA傳感器（圖4a）。RNApull-down試驗(yàn)后的Western印跡分析進(jìn)一步證實(shí)，與反義RNA相比，生物素標(biāo)記的circWDR37與鼻咽癌細(xì)胞中的PKR特異性結(jié)合（圖4b）。用抗PKR抗體進(jìn)行的RNA免疫沉淀（RIP）分析顯示circWDR37顯著富集（p < 0.05，圖4c）。一致地，免疫熒光測(cè)定證明circWDR37在細(xì)胞質(zhì)中與PKR共定位（圖4d）。接下來(lái)，為了確定PKR與circWDR37結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，作者產(chǎn)生了一系列PKR缺失突變體并進(jìn)行RIP分析。隨后的RT-qPCR分析顯示，PKR N末端的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（dsRBMs）與全長(zhǎng)PKR結(jié)合circWDR37的效率一樣高（p < 0.05，圖4e），這表明dsRBMs結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑KR結(jié)合circWDR37是至關(guān)重要的。
已經(jīng)確定PKR可以在感染和腫瘤促進(jìn)炎癥過(guò)程中啟動(dòng)NF-κB激活，作者進(jìn)一步評(píng)估了PKR是否誘導(dǎo)NPC中NFκB級(jí)聯(lián)的激活。結(jié)果表明PKR敲除顯著抑制了IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化（圖4f）。此外，p65的核轉(zhuǎn)位在PKR缺陷下減弱（圖4g，h），這與circWDR37敲除的影響一致。鑒于NF-κB級(jí)聯(lián)的激活是由磷酸化的PKR誘導(dǎo)的，作者進(jìn)一步評(píng)估circWDR37對(duì)NF-κB激活的影響是否依賴于PKR的磷酸化。值得注意的是，PKR在Thr446和Thr451這兩個(gè)對(duì)PKR激活至關(guān)重要的磷酸化位點(diǎn)的磷酸化被circWDR37沉默所抑制（圖4i）。相反，強(qiáng)制circWDR37表達(dá)能夠誘導(dǎo)PKR磷酸化，這表明circWDR37通過(guò)結(jié)合PKR并誘導(dǎo)其磷酸化來(lái)激活NF-κB途徑。
作者接下來(lái)探索circWDR37如何啟動(dòng)PKR磷酸化和激活。據(jù)報(bào)道，TAR RNA結(jié)合蛋白（TRBP）和PKR蛋白激活因子（PACT）是兩種雙鏈RNA結(jié)合蛋白，對(duì)PKR發(fā)揮相反的調(diào)節(jié)作用。因此，作者想知道circWDR37是否影響了PKR和PACT/TRBP之間的互動(dòng)。然而，在circWDR37缺失后，PKR與PACT或TRBP的結(jié)合沒(méi)有明顯變化（圖4j）。最近的證據(jù)表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA在雙鏈RBM上與PKR結(jié)合，誘導(dǎo)PKR單體形成同質(zhì)體并隨后磷酸化。然后，作者進(jìn)一步研究了circWDR37是否修飾PKR同型二聚化的形成。結(jié)果顯示，circWDR37沉默減少了HA與flag標(biāo)記的PKR之間的相互作用（圖4k），這表明circWDR37誘導(dǎo)了PKR的同二聚化。綜上所述，這些結(jié)果表明circWDR37在dsRBMs結(jié)構(gòu)域與PKR結(jié)合，誘導(dǎo)PKR二聚體化和磷酸化，從而激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)（圖4l）。
圖4 CircWDR37誘導(dǎo)PKR二聚體化和磷酸化
6、CircWDR37在非依賴于PKR激酶活性下促進(jìn)PKR刺激的IKKβ磷酸化
為了闡明circWDR37對(duì)PKR啟動(dòng)的NF-κB激活的調(diào)節(jié)作用，作者首先進(jìn)行了共免疫沉淀（co-IP）分析來(lái)評(píng)估circWDR37是否與NF-κB蛋白結(jié)合。然而，circWDR37和IKKβ、p65或IκBα之間沒(méi)有觀察到直接的相互作用。然后，作者評(píng)估circWDR37是否影響PKR與NF-κB成分的結(jié)合。首先，co-IP分析證明異位表達(dá)的PKR與IKKβ相互作用（圖5a），谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶（GST）pull-down分析證實(shí)了它們的直接相互作用（圖5b）。為了探索PKR - IKK/β相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，作者生成了IKKβ截?cái)嗤蛔凅w，包括IKKβ-1（僅具有n端激酶結(jié)構(gòu)域（KD））、IKKβ-2,4（具有泛素化類域（ULD）和NEM結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD））、IKKβ-2,3（ULD與二聚化所需的非旋支架/二聚化結(jié)構(gòu)域（SDD）結(jié)合）和IKKβ-3,4（SDD與NBD結(jié)合）（圖5c）。進(jìn)一步的co-IP分析揭示了IKKβ-2,4和IKKβ-3,4突變體，但是沒(méi)有NBD結(jié)構(gòu)域的突變體與PKR的結(jié)合效率不如全長(zhǎng)的IKKβ（圖5d），并且PKR的KD結(jié)構(gòu)域與IKKβ特異性相互作用（圖5e）。這些結(jié)果表明，IKKβ和PKR之間的相互作用特別依賴于IKKβ的NBD結(jié)構(gòu)域和PKR的KD結(jié)構(gòu)域。
接下來(lái)，作者評(píng)估了circWDR37是否促進(jìn)了PKR和IKKβ之間的相互作用。co-IP分析顯示，在circWDR37過(guò)表達(dá)后，PKR與IKKβ的結(jié)合增強(qiáng)（圖5f）。盡管先前的研究報(bào)道PKR通過(guò)磷酸化IKKβ啟動(dòng)NF-κB激活，但是調(diào)節(jié)機(jī)制是否依賴于PKR激酶活性仍不清楚。使用體外激酶試驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)純化的GST標(biāo)記的PKR以劑量依賴的方式直接磷酸化GST-真核起始因子2（eIF2α），一種公認(rèn)的PKR底物，但不磷酸化GST-IKKβ。綜上所述，上述發(fā)現(xiàn)表明circWDR37促進(jìn)PKR與IKK-β的結(jié)合，從而以獨(dú)立于PKR激酶活性的方式誘導(dǎo)IKK-β磷酸化。
7、CircWDR37-磷酸化PKR與抑制性IκB結(jié)合并釋放p65
P65與p50的復(fù)合體是含量最豐富的NF-κB蛋白。之前的一項(xiàng)研究報(bào)告稱PKR并不直接相互作用或磷酸化p65。令人驚訝的是，作者發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞中PKR缺失后p65磷酸化減弱（圖4f）。此外，co-IP實(shí)驗(yàn)顯示PKR與p65結(jié)合（圖5g），GST pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖5h）。為了研究與PKR-p65結(jié)合有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，作者根據(jù)p65的功能結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了p65截?cái)嗤蛔凅w：Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD）（圖5i）。co-IP分析表明，p65中的RHD結(jié)構(gòu)域與PKR的結(jié)合效率與p65的全長(zhǎng)一樣，而TAD結(jié)構(gòu)域則沒(méi)有p65的結(jié)合能力（圖5j）。此外，KD結(jié)構(gòu)域，而不是PKR中的dsRBM與p65特異性相互作用（圖5k）。
考慮到RHD結(jié)構(gòu)域是p65與抑制蛋白IκBα結(jié)合所必需的，作者探討了PKR對(duì)p65與IκBα相互作用的影響。強(qiáng)制表達(dá)PKR顯著減少了IκBα與p65的結(jié)合（圖51），表明PKR占據(jù)了p65上的IκBα結(jié)合位點(diǎn)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)PKR與IκBα在物理上相互作用，這一作用因異位CircWDR37表達(dá)而增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)與先前的一項(xiàng)研究相一致，該研究表明PKR與IκBα相互作用并被磷酸化。接下來(lái)，作者研究了WDR37是否影響PKR和IκBα結(jié)合p65的競(jìng)爭(zhēng)。外源CircWDR37的增加促進(jìn)了PKR/IκBα復(fù)合體的形成（圖5m），并以劑量依賴的方式減少P65/IκBα復(fù)合體的形成（圖5n），這提示CircWDR37促進(jìn)PKR與IκBα的結(jié)合，并從抑制性的IκBα蛋白中釋放p65。
由于CircWDR37啟動(dòng)了PKR的磷酸化并觸發(fā)了NF-κB信號(hào)，作者進(jìn)一步評(píng)估了CircWDR37誘導(dǎo)的PKR磷酸化在PKR/IκBα相互作用中的作用。作者用天冬氨酸（T446DT451D）取代Thr446和Thr451殘基，構(gòu)建了突變的PKR。體外純化的PKRT446DT451D蛋白與迫使其去磷酸化的小牛腸道堿性磷脂預(yù)先孵育，然后進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，PKR去磷酸化減少了PKR與IκBα的相互作用，提示PKR與IκBα的結(jié)合能力依賴于PKR的磷酸化（圖5o）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明circWDR37磷酸化的PKR結(jié)合并從p65中分離IκBα，從而釋放p65轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中（圖5p）。
圖5 CircWDR37促進(jìn)PKR與IKKβ的結(jié)合，并促進(jìn)PKR與IκB 的相互作用，從而從抑制性IκBκ中釋放p65
8、PKR是circWDR37的功能性中介
PKR在鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和衰老中的作用尚不清楚。接下來(lái)，作者研究了PKR在鼻咽癌細(xì)胞中的功能。與circWDR37缺失的影響類似，PKR敲低顯著抑制鼻鼻癌細(xì)胞的遷移、侵襲和集落形成（p < 0.05，圖6a）。此外，順鉑或吉西他濱治療后，PKR缺失顯著增加SA-β-gal染色的鼻咽癌細(xì)胞（p < 0.05，圖6b）。在順鉑或吉西他濱處理的鼻咽癌細(xì)胞中，衰老標(biāo)記物p16INK4a的表達(dá)持續(xù)增加，而細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)因PKR缺失而降低（圖6c）。這些結(jié)果證實(shí)了PKR缺失對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，以及對(duì)細(xì)胞衰老的促進(jìn)作用。此外，PKR耗竭后化療誘導(dǎo)的衰老鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著受損（p<0.05，圖6d）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，PKR沉默的作用類似于circWDR37基因敲除，促進(jìn)了化療誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的衰老，并限制了它們?cè)隗w外的遷移和侵襲。
為了證實(shí)circWDR37通過(guò)激活PKR來(lái)對(duì)抗化療誘導(dǎo)的衰老和促進(jìn)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移，作者用circWDR37-siRNA和PKRT446DT451D過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞。在T446和T451殘基持續(xù)的PKR磷酸化顯著逆轉(zhuǎn)了circWDR37缺失的鼻咽癌細(xì)胞減弱的遷移和侵襲（p<0.05，圖6e）。此外，異位PKRT446DT451D表達(dá)顯著抑制了circWDR37敲除誘導(dǎo)的增強(qiáng)的化療誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老（p < 0.05，圖6f）。雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因分析和蛋白質(zhì)印跡顯示，外源PKRT446DT451D操作顯著恢復(fù)了circWDR37缺失抑制的NFκB激活（圖6g，h）。此外，PKRT446DT451D的過(guò)表達(dá)取消了circWDR37基因敲除細(xì)胞中衰老標(biāo)記物p16INK4a表達(dá)的增加和細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)的降低（圖6h）。這些結(jié)果表明，PKR的激活在circWDR37介導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的抗衰老、遷移和侵襲過(guò)程中起關(guān)鍵作用。
圖6 PKR是CircWDR37的功能調(diào)節(jié)因子
9、CircWDR37缺失損害NPC細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移
為了在體內(nèi)驗(yàn)證circWDR37的功能，作者首先建立了一個(gè)腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。將穩(wěn)定的WDR37基因敲除的S18細(xì)胞或雜亂對(duì)照的S18細(xì)胞移植到裸鼠的足墊中。4周后，切除足墊和腹股溝淋巴結(jié)上的原發(fā)腫瘤（圖7a）。H&E染色顯示，在WDR37基因敲除組，足底腫瘤侵襲性較弱，對(duì)皮膚和肌肉的侵襲相對(duì)較少（圖7b）。根據(jù)泛角蛋白染色的結(jié)果，circWDR37缺失顯著減少了腫瘤體積（p<0.05，圖7c，d）和腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率（p<0.05，圖7e，f）。接下來(lái)，將穩(wěn)定的WDR37缺失的S18細(xì)胞或雜亂對(duì)照的S18細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)，建立肺轉(zhuǎn)移定植模型。如圖7g，h所示，WDR37缺失可顯著減少體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)（p<0.05）。此外，H&E染色顯示，抑制circWDR37可顯著減少和縮小肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（p<0.05，圖7i，j）。總之，這些結(jié)果證實(shí)circWDR37敲低抑制了體內(nèi)NPC細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
作者進(jìn)一步使用腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型研究circWDR37在順鉑和吉西他濱治療后對(duì)NPC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。在腫瘤形成后，每隔3天給小鼠腹腔注射順鉑（5mg·kg-1）和吉西他濱（50mg·kg-1）。與sh-載體對(duì)照組相比，circWDR37基因敲除抑制了順鉑和吉西他濱治療后足墊腫瘤對(duì)皮膚和肌肉的侵襲（圖7K）。此外，經(jīng)順鉑和吉西他濱治療后，WDR37缺失組的腹股溝淋巴結(jié)體積和轉(zhuǎn)移率顯著降低（p<0.05，圖7l-o）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，具有CircWDR37基因敲除的鼻咽癌細(xì)胞可以從順鉑和吉西他濱的治療中受益于轉(zhuǎn)移控制。
圖7 CircWDR37缺陷對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響
10、CircWDR37低表達(dá)與鼻咽癌患者良好的預(yù)后和較好的誘導(dǎo)化療療效相關(guān)
根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，作者的下一個(gè)目標(biāo)是利用RT-qPCR來(lái)驗(yàn)證circWDR37在140例鼻咽癌組織中表達(dá)的臨床潛力。根據(jù)X-tile分析將患者分為WDR37高表達(dá)組（n=101）和低表達(dá)組（n=39）。生存分析顯示，circWDR37高表達(dá)患者的總生存率、無(wú)瘤生存期（DFS）和無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期（DMFS）顯著低于circWDR37低表達(dá)患者（p<0.05，圖8a-c）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，WDR37表達(dá)水平、N分期和治療前血漿EBV DNA是影響鼻咽癌預(yù)后的獨(dú)立因素（p<0.05，圖8d-f）。這些結(jié)果表明，在鼻咽癌患者中，circWDR37的高表達(dá)提示預(yù)后不良，并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。
利用上述隊(duì)列中63名患者在放療前接受吉西他濱或順鉑誘導(dǎo)化療的優(yōu)勢(shì)，作者評(píng)估了circWDR37表達(dá)與患者對(duì)順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)化療的反應(yīng)之間的關(guān)系。患者在誘導(dǎo)化療前后進(jìn)行了磁共振成像（圖8G）。在大多數(shù)患者應(yīng)答者中（40/56），circWDR37的表達(dá)水平較低（圖8h），與circWDR37高表達(dá)的患者相比，他們的DFS和DMF更好（p<0.05，圖8i，j），這表明circWDR37低表達(dá)的患者在順鉑或吉西他濱誘導(dǎo)化療中獲得了更好的療效和生存。綜上所述，這些結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在鼻咽癌患者中，circWDR37的低表達(dá)與順鉑或吉西他濱化療的反應(yīng)以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的降低之間存在關(guān)聯(lián)。
圖8 CircWDR37的高表達(dá)與鼻咽癌患者的不良預(yù)后和對(duì)誘導(dǎo)化療缺乏反應(yīng)性有關(guān)
總之，此研究揭示了circWDR37激活的PKR通過(guò)NF-κB觸發(fā)的SASP成分基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)鼻咽癌中化療誘導(dǎo)的衰老腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。由于circWDR37的缺失使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療引起的衰老敏感、減少轉(zhuǎn)移、增加化療的益處，circWDR37可能成為預(yù)測(cè)化療療效的潛在生物標(biāo)志物和鼻咽癌有吸引力的治療靶點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法
基因芯片測(cè)序分析、RNA提取和RT-qPCR、RNA FISH -免疫熒光顯微鏡、RNA免疫沉淀反應(yīng)、RNA pull down試驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
Q. Li, Y.H. Zhao, C. Xu,et al. Chemotherapy-Induced Senescence Reprogramming Promotes Nasopharyngeal Carcinoma Metastasis by circRNA-Mediated PKR Activation, Advanced Science, 2023, 10(8). doi: 10.1002/advs.202205668.