CD36+癌相關(guān)成纖維細(xì)胞通過分泌巨噬細(xì)胞遷移抑制因子為肝癌提供免疫抑制微環(huán)境

       肝細(xì)胞癌(HCC)是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因，慢性乙型肝炎(HBV)病毒感染是主要危險(xiǎn)因素。超過80%的HCC病例的特征是由成纖維細(xì)胞的激活、增殖和積累引起的廣泛肝纖維化。HCC腫瘤微環(huán)境(TME)的一個(gè)顯著特征是大量的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)，它可以分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，直接或間接地支持癌細(xì)胞。在以往的研究中，CAF在人胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌和肺腫瘤中廣泛發(fā)現(xiàn)了不同的CAF亞型，并具有不同的功能。因此，CAFs的多面性表明它們包括不同的亞群，并且對(duì)基質(zhì)異質(zhì)性的更好理解可以解釋CAFs如何促進(jìn)腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)復(fù)雜性和功能可塑性。作者的研究結(jié)果提供了一個(gè)全面的轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述，并揭示了CD36⁺ CAFs, CD33⁺ MDSCs和HCC細(xì)胞之間新的交互，為HCC提供了一個(gè)潛在的微環(huán)境靶向治療方式。本文于2023年3月發(fā)表于《Cell Discovery》，IF=33.5。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1、單細(xì)胞分析揭示了人類HCC腫瘤的復(fù)雜性

       為了全面表征人類HCC中存在的細(xì)胞群，作者采用scRNA-seq方法對(duì)原發(fā)腫瘤中的大量細(xì)胞進(jìn)行分析。來自未經(jīng)治療的HBV相關(guān)HCC患者的7個(gè)腫瘤和其中4個(gè)患者的鄰近肝組織被酶酶消化以產(chǎn)生單細(xì)胞懸液(圖1A;110658細(xì)胞)。嚴(yán)格過濾后，保留90572個(gè)細(xì)胞作進(jìn)一步分析。在基因表達(dá)歸一化之后，作者分別使用主成分分析和均勻流形近似和投影(UMAP)進(jìn)行了降維和聚類(圖1B)。利用已知的標(biāo)記基因，細(xì)胞可以劃分為9種不同的細(xì)胞類型(圖1B):上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞(5059個(gè)細(xì)胞，5.6%，用EPCAM、ALDH1A1和ALB標(biāo)記);B細(xì)胞(1332個(gè)，1.5%，標(biāo)記有MS4A1和CD79A);T細(xì)胞24895個(gè)，占27.5%，CD3D和CD3E標(biāo)記;自然殺傷細(xì)胞(NK) 13868個(gè)，占15.3%，標(biāo)記FGFBP2和FCG3RA;髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)(11087個(gè)細(xì)胞，12.2%，用ITGAM和CD33標(biāo)記);單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞(9978個(gè)，占11.0%，標(biāo)記為CD68、CD163和CD14);樹突狀細(xì)胞(7784個(gè)，8.6%，用ITGAX標(biāo)記);成纖維細(xì)胞(2495個(gè)，2.8%，標(biāo)記有ACTA2和COL1A2);內(nèi)皮細(xì)胞(14074個(gè)，占15.5%，標(biāo)記有PECAM1和vWF;圖1C)。點(diǎn)圖所示的差異表達(dá)基因(DEGs)和標(biāo)記基因證實(shí)了準(zhǔn)確性(圖1C)。

圖1. 人HBV相關(guān)HCC中不同的成纖維細(xì)胞亞群

2、人類HCC中5種CAF亞型的鑒定和分子特征

       α-SMA免疫組化(IHC)染色顯示，超過80%的HCC病例表現(xiàn)為由成纖維細(xì)胞激活和積累引起的廣泛肝纖維化(圖1D)。作者在來自7個(gè)HBV相關(guān)HCC組織的scRNA-seq分析中對(duì)1835個(gè)CAFs進(jìn)行了分類，并將這些細(xì)胞聚集成5個(gè)亞群(圖1E)。所有5個(gè)亞簇都表達(dá)高水平的典型成纖維細(xì)胞標(biāo)記，如ACTA2 (α-SMA)、COL1A2和COL1A1;然而，每個(gè)亞簇顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組特征(圖1F、G)。亞群0 CAF占CAF群體的大部分(40%)，其特征是微血管特征基因，如MYH11、MUSTN1和MCAM(圖1F、G)。因此，作者將其命名為血管CAFs (vCAFs, vCAFs-c0- myh11)。vCAFs的GO和KEGG分析表明，血管平滑肌收縮和對(duì)鈣離子的反應(yīng)顯著富集，與它們的微血管特征一致(圖1H、I)。亞簇2 CAFs表達(dá)低水平的α-SMA和高水平的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)特征，包括膠原分子(COL5A1和COL6A3)、骨膜蛋白(POSTN)、LUM、DCN和FAP(圖1F、G)。有趣的是，GO分析表明ECM和膠原原纖維組織相關(guān)顯著富集。因此，作者相應(yīng)地將它們命名為基質(zhì)CAFs (mCAFs, mCAFs-c2-LUM，圖1H、I)。與mCAFs-c2-LUM類似，亞群1 CAFs也表達(dá)高水平的COL6A3和COL1A1以及高水平的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因(CD36和STEAP4，圖1F、G)。此外，該亞簇顯著富集于ECM、膽固醇代謝、脂肪酸代謝標(biāo)志和活性氧(ROS)途徑相關(guān)(圖1H、I)，表明該亞簇可能參與ECM和膽固醇代謝。因此，該亞簇中的CAFs被命名為脂質(zhì)加工(lp)-mCAFs (lpmCAFs, lpmCAFs-c1- CD36;圖1F、G)。亞群3 CAFs表達(dá)高水平的脂質(zhì)加工標(biāo)志物，包括APOA1和APOC1(圖1G)。有趣的是，GO和KEGG分析表明，這些CAFs在蛋白質(zhì)-脂質(zhì)復(fù)合物重塑和脂肪酸代謝標(biāo)志中顯著富集;因此，作者將它們命名為脂質(zhì)加工CAFs (lpCAFs, lpCAFs-c3- APOA1;圖1H、I)。與之前報(bào)道一致，作者發(fā)現(xiàn)亞群4 CAF表達(dá)主要的組織相容性復(fù)合體II (MHCII)基因，如CD74和HLA-DRA，以及趨化因子相關(guān)基因，如CCL5(圖1F、G)。此外，在該亞簇中富集的GO項(xiàng)和KEGG通路與MHCII類蛋白復(fù)合體和抗原加工和呈遞有關(guān)(圖1H、I);因此，作者稱之為抗原呈遞CAFs (apCAFs, apCAFs-c4- HLA-DRA)。最后，為了探討不同病因?qū)е碌腃AF亞型的異質(zhì)性，作者對(duì)7例非HBV相關(guān)HCC腫瘤進(jìn)行了scRNA測序，發(fā)現(xiàn)與HBV-HCC相比，非HBV HCC(包括酒精型、脂肪肝或藥物性HCC)中CD36+ CAF和lpCAFs的比例顯著降低(圖1J、I)，這可能是HBV相關(guān)HCC中HBV蛋白誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激引起的。最后，作者使用多重免疫熒光(mIF)染色證實(shí)了人類HCC樣本中主要CAF亞群的存在(圖1M)。

3、小鼠HCC腫瘤中CAF亞型的單細(xì)胞分析概括了人類HCC中發(fā)現(xiàn)的亞型

       作者在人類HCC標(biāo)本中的結(jié)果證實(shí)了5個(gè)CAF亞簇的存在。為了更深入研究CAF，作者將研究擴(kuò)展到小鼠HCC模型。作者之前的研究顯示，在作者的HBV相關(guān)HCC患者隊(duì)列中，CTNNB1(58%)和TP53(19%)是兩個(gè)突變最多的基因。因此，作者建立CTNNB1N90;Trp53KO HCC小鼠模型，模擬HCC遺傳背景(圖2A)。在此模型的基礎(chǔ)上，將來自HCC小鼠的7個(gè)腫瘤分離成單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過嚴(yán)格過濾，共獲得63977個(gè)活細(xì)胞(圖2B)。對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類分析得到10個(gè)簇，中位數(shù)為6054個(gè)轉(zhuǎn)錄本，每個(gè)簇有2262個(gè)基因(圖2B)。與人類HCC相似，小鼠HCC腫瘤含有大量髓系細(xì)胞(約30%)，主要由巨噬細(xì)胞和MDSCs組成，還有一小部分DC。成纖維細(xì)胞在HCC腫瘤中的比例與人類HCC樣本相似(占所有細(xì)胞的2.7%)。為了進(jìn)一步辨別成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，作者在作者的scRNA-seq分析中對(duì)來自7個(gè)小鼠HCC腫瘤的1746個(gè)CAFs進(jìn)行了分類，并將這些CAFs聚類為7個(gè)亞群(圖2C)。所有7個(gè)亞簇都表達(dá)高水平的典型成纖維細(xì)胞標(biāo)記物，如Col1a2和Col1a1(圖2E);然而，每個(gè)亞簇顯示出不同的轉(zhuǎn)錄組特征(圖2D、E)。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)在人類HCC腫瘤中鑒定的所有5種CAF亞型在小鼠HCC組織中也存在(圖2C)。此外，5個(gè)小鼠CAF亞群具有與人類CAF相似的群體和基因特征，包括vCAFs、mCAFs、CD36⁺CAFs、lpCAFs和apCAFs。最后，作者使用特異性標(biāo)記物，包括Myh11、Lum、Acta2、Cd36和H2-Aa進(jìn)行mIF染色，以證實(shí)主要CAF簇也存在于小鼠HCC組織中(圖2G)。

圖2. 小鼠HCC組織中不同的成纖維細(xì)胞亞群

4、CAF亞型特異性轉(zhuǎn)錄因子和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

       接下來，作者試圖鑒定TFs及其靶向基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以更好地了解CAF亞型是如何在遺傳上建立和維持的。為此，作者應(yīng)用軟件SCENIC來識(shí)別在一種CAF亞型中高度活躍的TFs及其靶標(biāo)。作者觀察到vCAFs在MEF2C和FOS中富集(圖3A、B)，之前認(rèn)為MEF2C和FOS可以調(diào)節(jié)新生血管生成。此外，MEF2C的靶基因，如MYLK、ACTA2和MYH11，在vCAFs中上調(diào)(圖3D)。TWIST1和CREB3L1是mCAFs中表達(dá)量最高的TFs(圖3A、B)， TWIST1是CAF轉(zhuǎn)分化的關(guān)鍵因子。此外，TWIST1的靶基因(COL1A1, MMP2)在mCAFs中上調(diào)最多(圖3D)。lpmCAFs (CD36+ CAFs)顯示CEBPD的高表達(dá)(圖3A、C)， CEBPD是一種已知的控制與脂質(zhì)代謝和EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。脂蛋白脂肪酶(LPL)靶基因在lpmCAFs中上調(diào)(圖3D)。除CEBPD外，lpCAFs還高表達(dá)CEBPA和MAFB(圖3A、C)，這兩種已知的TFs參與促進(jìn)LDL代謝轉(zhuǎn)錄程序。最后，apCAFs高表達(dá)IKZF1和RUNX3(圖3A、C)，它們與巨噬細(xì)胞極化和T細(xì)胞募集有關(guān)。為了檢測在這些小鼠CAF亞群中具有活性的主調(diào)控因子，進(jìn)行了SCENIC分析，結(jié)果顯示Mef2c和Foxf1是小鼠vCAFs中的活性TFs基因，與人類vCAFs類似(圖3E、F)。同樣，Twist1、Cebpd、Cebpa和Ikzf1也分別是小鼠mCAFs、CD36+ CAFs、lpCAFs和apCAFs中的活性TFs基因(圖3E)。總的來說，這些結(jié)果確定了在已確定的CAF亞型中驅(qū)動(dòng)或維持基因表達(dá)程序的關(guān)鍵TFs，進(jìn)一步深入了解HCC腫瘤中CAF異質(zhì)性的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖3. CAF亞型特異性TF以及不同CAF與MDSCs之間的相互作用

5、CD36+ CAF與MDSCs呈正相關(guān)，并且在HCC腫瘤中與MDSCs關(guān)系密切

       在人類或小鼠HCC腫瘤中確定了CAF亞型后，作者下一步探索了CAF與TME中其他細(xì)胞之間的特定串?dāng)_機(jī)制。值得注意的是，在所有已知的配體-受體對(duì)中，MIF信號(hào)通路由MIF配體及其CD74/CXCR4受體主導(dǎo)。有趣的是，通常和高度表達(dá)CD36的lpmCAFs和lpCAFs是作用于MDSCs的MIF配體的最主要來源。進(jìn)一步的免疫組化實(shí)驗(yàn)表明CD36的表達(dá)主要位于HCC間質(zhì)區(qū)。因此，作者使用特異性表面標(biāo)記物在lpmCAFs (c1-mCAF-CD36)和lpCAFs這兩個(gè)亞群中鑒定了CD36，發(fā)現(xiàn)它們都在脂肪形成途徑中富集(圖3G)，占HCC中CAF群體的35%，表明它們在HCC進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。進(jìn)一步的mIF實(shí)驗(yàn)表明，與小鼠和人體組織的鄰近肝組織相比，CD36+ CAFs在腫瘤組織中特異性浸潤(圖3H、I)。首先，作者研究了CD36+ CAFs與TME內(nèi)的效應(yīng)T細(xì)胞MDSCs之間是否存在相關(guān)性。作者的scRNA-seq數(shù)據(jù)和TCGA數(shù)據(jù)顯示CD36+ CAFs和MDSCs之間呈正相關(guān)(圖3J)，但觀察到效應(yīng)T細(xì)胞(GZMB+ CD8+)呈負(fù)相關(guān)(圖3J)，這一點(diǎn)在30例原發(fā)性HBV相關(guān)病例的石蠟包埋腫瘤切片中的IF檢測中得到了驗(yàn)證(圖3K-I)。此外，對(duì)12例HCC腫瘤進(jìn)行單細(xì)胞核測序(snRNA-seq)，發(fā)現(xiàn)CD36+ CAFs的數(shù)量與MDSCs呈正相關(guān)(圖3M)。接下來，作者驗(yàn)證了CD36+ CAFs和MDSCs之間的相互作用。mIF染色顯示CD36+ CAFs比CD36 - CAFs更接近MDSCs(圖3N)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明CD36+CAFs可能在HCC中具有有效的免疫抑制作用。

6、流式細(xì)胞術(shù)分離肝癌細(xì)胞CAF亞型

       為了分析CAF亞群，作者檢查了單細(xì)胞數(shù)據(jù)，并鑒定了在每個(gè)CAF亞群中獨(dú)特表達(dá)的表面蛋白。使用CD36、CD146、FAP和MHCII抗體，將CAFs分離成四組細(xì)胞:(1)CD36陽性、(2)MHCII陽性、(3)FAP陽性和(4)CD146陽性細(xì)胞，推測分別對(duì)應(yīng)于CD36+ CAFs、apCAFs、mCAFs和vCAFs(圖4A)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在CD31和EpCAM雙陰性人群中，小鼠和人類HCC腫瘤中CAF亞型的比例大致相似(圖4B)。為了驗(yàn)證該策略是否適用于CAF分選，作者通過FACS分離細(xì)胞，并進(jìn)行qPCR分析。所有四個(gè)CAF亞群均高表達(dá)泛成纖維細(xì)胞標(biāo)記物Col1a1、Col2a1和Acta2(圖4C)。CD36陽性CAF的獨(dú)特之處在于它們高表達(dá)Cd36、Fabp4和Sh3bp5，以及l(fā)pCAF標(biāo)記物Fabp5、Apoc1和Fasn(圖4C)。MHCII陽性的CAFs在Cd74和H2-Ab1的高表達(dá)方面是十分顯著的(圖4C)。FAP陽性細(xì)胞顯示mCAF標(biāo)記物L(fēng)um、Col5a1、Col6a3、Timp2、Mmp2和Twist1的相對(duì)高表達(dá)(圖4C)。Mcam陽性的cas顯示vCAF標(biāo)記Myh11、Myh9、Mustn1和Rgs5的高表達(dá)(圖4C)。最后，F(xiàn)AP陽性細(xì)胞顯示mCAF趨化因子(如Lum、Mmp2和Mmp1)的相對(duì)表達(dá)顯著升高，表明該群體中mCAFs富集(圖4C)。這些結(jié)果表明，Lrat譜系間質(zhì)細(xì)胞是小鼠HCC發(fā)展過程中CD36+ CAFs的主要來源。

圖4. CD36介導(dǎo)OxLDL攝取，通過脂質(zhì)過氧化/p38/ cebp軸促進(jìn)MIF在CD36⁺ CAFs中的表達(dá)

7、CD36介導(dǎo)OxLDL攝取，通過脂質(zhì)過氧化/p38/ CEBP軸促進(jìn)MIF在CD36+ CAFs中的表達(dá)

       為了檢測不同CAF產(chǎn)生的MIF水平，我們通過FACS分離不同CAF亞型。進(jìn)一步的qPCR和ELISA實(shí)驗(yàn)表明，來自CD36+ CAFs的MIF表達(dá)明顯高于來自vCAFs、mCAFs、apCAFs和hsc的MIF表達(dá)(圖4D、E)?；谶@些結(jié)果，我們隨后將重點(diǎn)放在CD36+ CAFs的這一亞群上進(jìn)行進(jìn)一步的研究。我們還從HCC組織中分離和擴(kuò)增了CD36+ CAFs。Western blotting和ELISA分析顯示，當(dāng)CD36在CD36+ CAFs中沉默時(shí)，CD36+ CAFs表達(dá)和分泌的MIF減少(CD36kd CAFs;圖4F)，表明MIF的表達(dá)可能受到CD36的調(diào)控。重要的是，這些結(jié)果表明CD36+ CAFs可能通過旁分泌信號(hào)促進(jìn)MDSCs中某些促腫瘤功能的獲得。CD36是一種清道夫受體，在脂質(zhì)代謝中起作用，并被報(bào)道參與炎癥反應(yīng)和代謝紊亂，如糖尿病和肥胖。在免疫系統(tǒng)中，CD36已被報(bào)道介導(dǎo)樹突狀細(xì)胞抗原獲取和呈遞，并支持調(diào)節(jié)性t細(xì)胞功能。然而，人們對(duì)其在caf中的作用知之甚少。與我們通過CAF scRNA-seq分析確定的信號(hào)通路相似(圖4)，我們發(fā)現(xiàn)CD36+ cas比CD36kd cas具有更高的脂質(zhì)過氧化相關(guān)基因表達(dá)(圖4H)。使用熒光偶聯(lián)OxLDL和流式細(xì)胞術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)CD36+ CAFs比CD36kd CAFs具有更高的OxLDL攝取率(圖4I、J)。基于BODIPY 581/591 C11脂質(zhì)過氧化測定，CD36+ CAFs與CD36kd CAFs相比，脂質(zhì)過氧化也顯著增加(圖4K)。此外，我們想確定OxLDL是否會(huì)增加CD36+ CAFs中的脂質(zhì)過氧化。首先，我們測量了OxLDL對(duì)CD36+ CAFs中脂質(zhì)過氧化的影響，結(jié)果顯示，OxLDL而非LDL以劑量依賴的方式增強(qiáng)了CD36+ CAFs中的脂質(zhì)過氧化(圖4I)。氧化應(yīng)激，包括脂質(zhì)過氧化，可以激活p38激酶及其下游信號(hào)通路。因此，我們通過測量CD36+ CAF中p38的磷酸化來檢測OxLDL是否可以激活p38。我們發(fā)現(xiàn)OxLDL在CD36+ CAF中誘導(dǎo)p38磷酸化，但在CD36kd CAF中誘導(dǎo)的程度要小得多，并且Toco或SSO的添加減少了OxLDL誘導(dǎo)的p38磷酸化(圖4M)。此外，體內(nèi)CD36+ CAFs中p38磷酸化的富集程度高于CD36kd或CD36陰性CAFs(圖4N)。這表明OxLDL通過CD36和脂質(zhì)過氧化促進(jìn)p38活化。接下來，我們想確定p38是否作用于OxLDL-CD36信號(hào)的下游以促進(jìn)MIF表達(dá);因此，我們在體外用OxLDL處理CD36+ CAFs，無論是否存在p38抑制劑SB203580。結(jié)果顯示，在OxLDL存在的情況下，p38抑制部分挽救了MIF的分泌(圖4O)，表明OxLDL部分通過p38激活促進(jìn)MIF分泌。從我們的SCENIC分析中，我們發(fā)現(xiàn)CEBP家族(CEBPA和CEBPD) tf對(duì)脂質(zhì)代謝至關(guān)重要，在CD36+ CAFs(包括lpmCAFs和lpCAFs)中特異性富集。先前的研究已經(jīng)確定p38MAPK是CEBPA和CEBPD激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，我們首先在CD36+ CAFs中檢測了MIF分泌是否依賴于p38誘導(dǎo)的CEBPA和CEBPD激活。當(dāng)CEBPA和CEBPD分別沉默時(shí)，我們觀察到MIF在經(jīng)OxLDL處理的CD36+ CAFs中顯著降低(圖4p)。然后，我們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，以確定MIF啟動(dòng)子中CEBPA或CEBPD的潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖4P)。接下來，進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CEBPA和CEBPD都可以直接結(jié)合到MIF啟動(dòng)子上(圖4P)。綜上所述，這些結(jié)果表明CD36介導(dǎo)OxLDL攝取，通過脂質(zhì)過氧化/p38/CEBP軸促進(jìn)MIF表達(dá)。

8、CD36+ CAFf衍生的MIF通過IL-6/STAT3激活增強(qiáng)了MDSCs促進(jìn)免疫抑制性TME和腫瘤干細(xì)胞的能力

       基于上述結(jié)果表明，CAFs的數(shù)量與MDSCs的數(shù)量相關(guān)，作者假設(shè)CD36+ CAFf衍生的MIF促進(jìn)了CD33+ MDSC的擴(kuò)增。為了確定來自腫瘤細(xì)胞或CD36+ CAFs的MIF是否介導(dǎo)CD33+ MDSC擴(kuò)增的調(diào)節(jié)，從原發(fā)性人HBV相關(guān)或小鼠HCC腫瘤中分離人或小鼠CD36+ CAFs。使用CD36+ CAFs (CD36+ CAFs-CM)、CD36 - CAFs、CD36kd CAFs (CD36kd CAFs-CM)、CD36+ CAFs+MIF抑制(ISO-1)或CD74阻斷的條件培養(yǎng)基(CM)來處理MDSC前體，并測量CD33+ MDSCs的比例(圖5A、B)。發(fā)現(xiàn)CD36+ CAFs-CM、MIF增加了CD33+ MDSCs的數(shù)量(圖5C)。CD36+ CAFc - cm + ISO-1和CD36+ CAFc - cm + CD74阻斷在抑制CD33+ MDSC擴(kuò)增方面表現(xiàn)出良好的活性(圖5C)，這表明MIF分泌是CD36+ CAFs調(diào)控MDSC擴(kuò)增的關(guān)鍵介質(zhì)。然后，在免疫功能正常的小鼠原位HCC模型中，作者證明了共注射從小鼠HCC腫瘤中分離的CD36+ CAFs(~30:1)可顯著促進(jìn)小鼠肝臟中HCC腫瘤細(xì)胞的腫瘤生長或轉(zhuǎn)移，而特異性敲低CD36、抑制MIF或耗盡Gr-1+ MDSCs可大大減弱這種作用(圖5D、E)。共注射CD36+ CAFs可顯著增加腫瘤中Treg的浸潤，但減少效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞的浸潤(圖5F、G)，特異性敲低CD36、抑制MIF或消耗Gr-1+ MDSCs也會(huì)大大減弱這種浸潤(圖5F、G)。這些數(shù)據(jù)表明，CD36+ CAFs的促瘤作用是通過MDSCs的免疫抑制功能間接介導(dǎo)的。MDSCs可以通過幾種不依賴于接觸的機(jī)制促進(jìn)免疫抑制，包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)，已知iNOS可抑制實(shí)體瘤中CD8+ T和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性和功能。首先，為了研究CD36+ CAFs是否可以通過iNOS信號(hào)傳導(dǎo)來教育MDSCs增強(qiáng)其免疫抑制能力，作者從CD36+ CAFs、CD36kd CAFs或CD74阻斷細(xì)胞的原代CD36+ CAFs、CD33+ MDSCs或經(jīng)CM預(yù)處理的CD33+ MDSCs培養(yǎng)物中收集CM，并評(píng)估iNOS水平。CD36+ CAFc -MDSC-CM，而CD36kd + CAFc -MDSC-CM或CD36kd阻斷MDSC的CM，顯著促進(jìn)了MDSCs中iNOS的分泌(圖5H)。此外，作者的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，與MDSC- wt組相比，CD36+ CAF + MDSC組的CD69+、IFNG+ CD8+ T細(xì)胞比例顯著下調(diào)，但treg和PD1+CD8+ T細(xì)胞比例上調(diào)，而CD36+ CAF + MDSC + ISO-1或CD74阻斷只產(chǎn)生輕微影響(圖5I、J)。這表明CD36+ CAFs通過MIF/CD74/ iNOS軸以依賴CD36的方式增強(qiáng)了CD33+ MDSCs的免疫抑制能力。此外，作者使用裸小鼠原位HCC模型證明，共注射CD36+ CAFs可顯著促進(jìn)裸小鼠肝臟中腫瘤細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)移，而特異性敲低CD36、抑制MIF或耗盡Gr-1+ MDSCs可極大地減弱腫瘤細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)表明，CD36+ CAFs的促腫瘤作用是由MDSCs的非免疫抑制功能間接介導(dǎo)的，可能具有干細(xì)胞增強(qiáng)能力。最后，為了探索CD36+ CAFf衍生的MIF影響MDSCs的分子機(jī)制，作者進(jìn)行了RNA測序，并比較了MDSC-MIF組和MDSC組。結(jié)果顯示，核因子κB (NF-κB)信號(hào)通路被列為最重要的途徑，并被報(bào)道調(diào)節(jié)MDSCs中細(xì)胞因子的分泌，在CD36+ CAFf衍生的MIF預(yù)處理的MDSCs中被激活(圖5K、I)。為了研究導(dǎo)致CD36+ CAFf相關(guān)的MDSC擴(kuò)張的機(jī)械刺激的下游信號(hào)，作者首先檢測了CD36+ CAFs誘導(dǎo)的MDSCs和來自HCC患者外周血的MDSCs中NF-κB蛋白p65的磷酸化。作者發(fā)現(xiàn)CD36+ CAFs誘導(dǎo)的MDSCs中p65的磷酸化增加(圖5M)。據(jù)報(bào)道，p65激活可顯著誘導(dǎo)iNOS和IL-6分泌。ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CD36+ CAFs或MIF誘導(dǎo)的MDSCs中iNOS和IL-6分泌顯著上調(diào)(圖5N)。

圖5. CD36⁺ CAF衍生的MIF通過IL-6/ STAT3激活增強(qiáng)了MDSCs促進(jìn)免疫抑制性TME和腫瘤干細(xì)胞的能力

9、靶向CD36與免疫治療在肝癌小鼠模型中的協(xié)同作用

       根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，CD36+ CAFf來源的MIF促進(jìn)了免疫抑制性MDSC的積累，加速了HCC的進(jìn)展。為了進(jìn)一步研究CD36+和MIF+ CAFs是否在HCC發(fā)生過程中發(fā)揮作用，作者建立了CD36 (Acta2Cre; Cd36fl/fl)和MIF (Acta2Cre;Miffl/fl)條件敲除6周齡小鼠，確定在體內(nèi)敲除CD36或MIF時(shí)，HCC腫瘤負(fù)荷和MDSCs比例顯著降低(圖6A-D)，表明CD36+ CAFs參與HCC的發(fā)生。據(jù)報(bào)道，單核細(xì)胞MDSCs具有免疫抑制作用，與癌癥免疫治療反應(yīng)差有關(guān)。此外，已發(fā)現(xiàn)MDSCs誘導(dǎo)的癌癥干性可促進(jìn)多種癌癥類型的免疫治療抵抗。因此，治療性靶向或減少M(fèi)DSCs聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻斷劑可以增強(qiáng)t細(xì)胞免疫治療，達(dá)到最佳的抗腫瘤效果。為此，作者還假設(shè)CD36+ CAFs的數(shù)量與HCC患者免疫治療的療效有關(guān)。因此，作者首先研究了CD36+ CAFs在接受新輔助抗pd -1治療(托利哌單抗聯(lián)合lenvatinib作為可切除肝細(xì)胞癌的新輔助治療)的患者切除的HCC組織中的作用;臨床試驗(yàn)號(hào):NCT03867370)。結(jié)果顯示，CD36和αSMA共表達(dá)在抗pd -1反應(yīng)組中低于無反應(yīng)組，這表明CD36+ CAFs數(shù)量少預(yù)示著更好的HCC免疫治療反應(yīng)(圖6E、F)。然后，作者探索了單藥(CD36抑制劑或抗pd -1治療)和聯(lián)合治療策略(CD36抑制和抗pd -1治療)在C57/BJ6 CTNNB1N90;Trp53KO HCC模型和作者建立的抗PD-1耐藥HCC中的療效。有趣的是，聯(lián)合治療在這些HCC小鼠模型中顯示出明顯的抗腫瘤效果(圖6G-K),并改變了抗腫瘤免疫的免疫景觀，Tregs和MDSCs的比例降低，IFN-γ+和顆粒酶B+ CD8+ T細(xì)胞的比例增加(圖6I-M)。因此，腫瘤中CD36+ CAFs數(shù)量較少可能預(yù)示著HCC中更好的免疫治療應(yīng)答，并且SSO靶向CD36可以協(xié)同提高免疫治療的療效。

圖6. CD36⁺ CAFs預(yù)測肝癌免疫治療的療效，靶向MIF在肝癌小鼠模型中與免疫治療協(xié)同

結(jié)論

       總之，作者的研究結(jié)果在單細(xì)胞水平上提供了一個(gè)全面的HCC轉(zhuǎn)錄組學(xué)景觀，并確定了由脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的CD36+ CAFt分泌的MIF調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞免疫逃避的新機(jī)制。靶向CD36可有效提高免疫治療的療效。需要進(jìn)一步的研究來確定誘導(dǎo)不同CAF亞型形成和激活的腫瘤內(nèi)信號(hào)，并確定其他CAF亞型在TME和腫瘤免疫中的作用。

實(shí)驗(yàn)方法

單細(xì)胞測序、ELISA、CHIP、qPCR、WB、MIF染色、IHC、腫瘤成球試驗(yàn)、流失細(xì)胞術(shù)

參考文獻(xiàn)

Zhu GQ, Tang Z, Huang R, Qu WF, Fang Y, Yang R, Tao CY, Gao J, Wu XL, Sun HX, Zhou YF, Song SS, Ding ZB, Dai Z, Zhou J, Ye D, Wu DJ, Liu WR, Fan J, Shi YH. CD36+ cancer-associated fibroblasts provide immunosuppressive microenvironment for hepatocellular carcinoma via secretion of macrophage migration inhibitory factor. Cell Discov. 2023 Mar 6;9(1):25. doi: 10.1038/s41421-023-00529-zIF: 33.5 Q1 . PMID: 36878933; PMCID: PMC9988869.