生理代謝物α-酮戊二酸通過調(diào)節(jié)線粒體自噬和氧化應(yīng)激來改善骨關(guān)節(jié)炎

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-04-19
α-KG在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨和IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的含量減少,α-KG可通過調(diào)節(jié)線粒體自噬和氧化應(yīng)激來減輕骨關(guān)節(jié)炎的表型......

 

       骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種與年齡相關(guān)的代謝性疾病。低度炎癥和氧化應(yīng)激是OA最后的常見途徑。α-酮戊二酸(α-KG)是線粒體三羧酸(TCA)循環(huán)中必需的生理代謝產(chǎn)物,具有抗炎和抗氧化等多種功能,并且隨著年齡的增長,血清水平會(huì)降低。本研究旨在探討α-KG對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機(jī)制。作者首次定量檢測了α-KG在IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨組織和骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平。此外,對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞用不同濃度的α-KG進(jìn)行處理。分析軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解以及炎癥介質(zhì)。用核糖核酸測序的方法探討α-KG的作用機(jī)制,并進(jìn)一步檢測吞噬作用和氧化應(yīng)激水平。這些結(jié)果在前交叉韌帶切斷(ACLT)誘導(dǎo)的年齡相關(guān)性骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型中得到了驗(yàn)證。作者發(fā)現(xiàn)損傷的內(nèi)側(cè)軟骨α-KG含量比正常外側(cè)軟骨減少了31.32%,IL-1β誘導(dǎo)的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞比對(duì)照組減少了36.85%。α-KG可逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡,增加ACAN和COL2A1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),但抑制MMP13、ADAMTS5、IL-6和TNF-α的表達(dá)。在機(jī)制上,α-KG促進(jìn)有絲分裂,抑制ROS的產(chǎn)生,這種作用可被Mdivi-1(有絲分裂抑制物)所阻斷??傮w而言,α-KG在人骨關(guān)節(jié)炎軟骨和IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的含量減少。此外,補(bǔ)充α-KG可通過調(diào)節(jié)線粒體自噬和氧化應(yīng)激來減輕骨關(guān)節(jié)炎的表型,提示其有可能成為改善骨關(guān)節(jié)炎的治療靶點(diǎn)。本文于2023年6月發(fā)表于期刊《Redox Biology》,IF=11.4

主要技術(shù)路線

 

 

主要研究結(jié)果

1、人骨關(guān)節(jié)炎軟骨中α-KG含量及IL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

       α-KG是戊二酸的酮基衍生物之一(圖1A),戊二酸來自異檸檬酸,在生理上產(chǎn)生丁二酰輔酶A(圖1B)。因此,作者首先檢測了α-KG在IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨組織和軟骨細(xì)胞中的含量(圖1C)。結(jié)果表明,損傷內(nèi)側(cè)軟骨α-KG含量較正常外側(cè)軟骨降低31.32%(P<0.0821,圖1D),人軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β處理24 h后含量下降36.85%,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0821,圖1E)。然后,檢測α-KG對(duì)原代人軟骨細(xì)胞的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示,當(dāng)α-KG濃度小于2 mM或作用時(shí)間小于72h時(shí),對(duì)軟骨細(xì)胞活力無明顯影響(P<0.05,圖1F,G)。因此,作者觀察了2 mM α-KG作用24 h對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響。EDU結(jié)果顯示,IL-1β可抑制原代培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞的增殖,而α-KG可逆轉(zhuǎn)這一作用(圖1H和I)。流式細(xì)胞儀檢測顯示,IL-1β可促進(jìn)原代培養(yǎng)的人軟骨細(xì)胞的凋亡,α-KG也可在一定程度上減輕這一作用(圖1J和K)。

 

圖1 α-KG含量及其對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

 

2、α-KG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞骨性關(guān)節(jié)炎表型的影響

       除軟骨細(xì)胞外,細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是軟骨組織的另一個(gè)主要成分。因此,采用RT-qPCR方法檢測基質(zhì)合成相關(guān)基因(ACAN和COL2A1)和降解相關(guān)基因(MMP13和ADAMTS5)在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。結(jié)果表明,α-KG以濃度依賴的方式促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞ACAN和COL2A1 mRNA的表達(dá),抑制MMP13和ADAMTS5的表達(dá)(P<0.05,P<0.01,圖2A-D)。IF染色和免疫印跡結(jié)果顯示,α-KG以濃度依賴的方式促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞COL2A1蛋白表達(dá),抑制MMP13蛋白表達(dá)(P<0.01,圖2E-G)。進(jìn)一步檢測α-KG對(duì)炎癥介質(zhì)的影響。RT-qPCR法和Western印跡結(jié)果顯示,IL-1β可濃度依賴性地上調(diào)人軟骨細(xì)胞IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平,而α-KG則以濃度依賴的方式降低IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平(P<0.05,P<0.01,圖2G-I)。

 

圖2 α-KG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成、降解及炎癥反應(yīng)的影響

 

3、α-KG對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞線粒體自噬和ROS生成的影響

       為了探討α-KG減輕骨性關(guān)節(jié)炎表型的機(jī)制,對(duì)其進(jìn)行了測序。測序結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,IL-1β處理組降低了與基質(zhì)合成相關(guān)的基因(ACAN和COL2A1)的轉(zhuǎn)錄表達(dá),上調(diào)了與基質(zhì)降解(如MMP3、MMP9、MMP10、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL1、ADAMTS5、ADAMTS7和ADAMTS8)和炎癥介質(zhì)相關(guān)基因(如IL-1α、IL-1R、IL-6、IL-6R、NFKBIA、TNFRSF9和TNFRSF15)的表達(dá)(圖3A)。然而,與單獨(dú)處理IL-1β相比,α-KG與IL-1β聯(lián)合作用上調(diào)了與基質(zhì)合成相關(guān)的基因(COL2A1),下調(diào)了與基質(zhì)降解(如MMP9、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL2、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS9和ADAMTS12)和炎癥介質(zhì)(IL-6ST、IL-6R、NFKBIA、TNFSF8和TNFSF15)相關(guān)基因的表達(dá)(圖3B)。有趣的是,與線粒體自噬相關(guān)的基因表達(dá)的變化與與基質(zhì)合成、降解和炎癥介質(zhì)相關(guān)的基因的表達(dá)一致。IL-1β降低PINK1、ATG4D和JUN的轉(zhuǎn)錄表達(dá),而α-KG增加PINK1、PARKIN、ATG4D、JUN、TOMM7和DAPK2的表達(dá)(圖3A和B)。KEGG分析還顯示了與炎癥、增殖、凋亡、氧化磷酸化和有絲分裂相關(guān)的通路的變化(圖3C)。

       因此,進(jìn)一步用透射電子顯微鏡檢測有絲分裂吞噬作用。結(jié)果顯示,IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞線粒體形態(tài)正常、規(guī)則、完整,但腫脹、空泡化、密度降低、結(jié)構(gòu)不完整。α-KG的加入改善了線粒體結(jié)構(gòu),促進(jìn)了線粒體自噬,從而增加了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中受損線粒體的清除(圖3D)。免疫熒光共定位顯示α-KG增加了IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞中線粒體和溶酶體的相互作用(P<0.05,P<0.01,圖3E)。Bafilomycin A1,可以通過抑制溶酶體酸化阻止晚期自噬通量,被進(jìn)一步測定自噬通量。結(jié)果顯示,α-KG顯著增加IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的自噬通量(P<0.01)。RT-qPCR和western blot也證實(shí)α-KG上調(diào)了線粒體自噬標(biāo)志物(PINK1和Parkin)相關(guān)基因的表達(dá)(P < 0.05, P < 0.01,圖4A, B)。最后,檢測線粒體功能。結(jié)果表明,α-KG處理顯著提高了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞基礎(chǔ)呼吸、最大呼吸、ATP相關(guān)的線粒體呼吸和備用呼吸能力(P < 0.05, P < 0.01)。同時(shí),α-KG也能降低IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞中ROS的生成(P < 0.05, P < 0.01,圖4C)。提示α-KG增加骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的線粒體自噬,改善線粒體功能,抑制ROS生成。

 

圖3 α-KG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞線粒體自噬的影響

 

4、Mdivi-1對(duì)軟骨細(xì)胞α-KG活性的影響

       已經(jīng)證實(shí)Mdivi-1是一種線粒體自噬抑制劑。為了進(jìn)一步探討線粒體自噬在介導(dǎo)α-KG對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞骨關(guān)節(jié)炎表型的緩解作用中的作用,作者采用Mdivi-1聯(lián)合α-KG治療IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞。TEM和IF結(jié)果顯示,α-KG和Mdivi-1抑制了線粒體和溶酶體共定位,改善了線粒體形態(tài),增加了ROS的產(chǎn)生(P < 0.05, P < 0.01,圖3D和E,4C)。α-KG與Mdivi-1聯(lián)用也降低了PINK1和Parkin的轉(zhuǎn)錄組和蛋白表達(dá)(P < 0.05, P < 0.01,圖4A,B),這些結(jié)果表明Mdivi-1逆轉(zhuǎn)了α-KG對(duì)線粒體自噬的影響。

       用EdU和流式細(xì)胞術(shù)檢測軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡情況,發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可以抵消α-KG促進(jìn)增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用(且有增強(qiáng)的趨勢)(P = 0.0564, P < 0.01,圖1H-K)。補(bǔ)充α-KG后,藏紅花O染色增強(qiáng),但可被MDVI-1抑制(P<0.01,圖4D)。RT-qPCR結(jié)果顯示,Mdivi-1逆轉(zhuǎn)了α-KG誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成相關(guān)基因(ACAN和COL2A1)轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加(P<0.05,P<0.01,圖4E和F),基質(zhì)降解相關(guān)基因(MMP13和ADAMTS5) (P<0.05,P<0.01,圖4G),以及炎性介質(zhì)(IL-6和TNF-β)表達(dá)降低(P<0.01,圖4H和I)。Western印跡和進(jìn)一步證實(shí)Mdivi-1可抑制COL2A1蛋白表達(dá)的增加和MMP13、IL-6和TNF-α的表達(dá)降低(P=0.0559,P<0.05,P<0.01,圖4J)。

 

圖4 Mdvi-1對(duì)人軟骨細(xì)胞α-KG活性的影響

 

5、補(bǔ)充α-KG對(duì)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎表型的影響

       為進(jìn)一步評(píng)價(jià)α-KG的作用,采用ACLT建立大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型。番紅O-固色綠染色顯示,α-KG修復(fù)后,ACLT可引起軟骨脫落、潮標(biāo)中斷或消失、軟骨纖顫、軟骨裂隙和侵蝕、軟骨變薄和OARSI評(píng)分增加(P<0.01),這些可由α-KG恢復(fù)(P < 0.01,圖5A和B)。RT-qPCR顯示,與對(duì)照組相比,ACLT可下調(diào)軟骨基質(zhì)合成相關(guān)基因(ACAN和COL2A1)的表達(dá)水平,上調(diào)與基質(zhì)降解相關(guān)的基因(MMP13和ADAMTS5)和炎癥介質(zhì)(IL-6和TNF-α)的基因表達(dá)水平,而ACLT+α-KG組則相反(P<0.05,P<0.01,圖5C-H)。免疫組化進(jìn)一步證明,α-KG逆轉(zhuǎn)了ACLT誘導(dǎo)的COL2A1蛋白表達(dá)下降和MMP13水平升高(P<0.01,圖5I,J)。

 

圖5 補(bǔ)充α-KG對(duì)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型的影響

 

6、補(bǔ)充α-KG對(duì)軟骨組織線粒體自噬的影響

       最后,對(duì)軟骨組織進(jìn)行線粒體自噬實(shí)驗(yàn)。透射電子顯微鏡顯示,ACLT+α-KG組線粒體腫脹、空泡化、結(jié)構(gòu)不完整,線粒體形態(tài)正常、規(guī)則、完整(圖6A)。RT-qPCR和IHC證實(shí)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中PINK1和Parkin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)和Parkin的蛋白水平降低(P<0.05,P<0.01,圖6B,C)。在ACLT誘導(dǎo)的大鼠骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織中,PINK1和Parkin的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)也持續(xù)下降(P<0.05,P<0.01,圖6D-G)。然而,α-KG可逆轉(zhuǎn)上述作用(P<0.05,P<0.01,圖6D-G)。上述結(jié)果表明,α-KG可降低骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織的線粒體自噬水平,并促進(jìn)其軟骨組織的線粒體自噬作用。

 

圖6 補(bǔ)充或不補(bǔ)充α-KG的人OA軟骨和ACLT誘導(dǎo)的大鼠OA模型中線粒體自噬的變化

 

       總體而言,這項(xiàng)研究證實(shí),在人OA軟骨和IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中,α-KG(線粒體TCA循環(huán)的一種生理代謝產(chǎn)物)的含量降低。此外,補(bǔ)充α-KG可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡抑制,逆轉(zhuǎn)體內(nèi)外細(xì)胞外基質(zhì)合成減少和降解增加以及炎癥反應(yīng),減少氧化應(yīng)激。這是由α-KG促進(jìn)軟骨細(xì)胞和軟骨組織線粒體自噬的能力介導(dǎo)的。此外,線粒體自噬抑制劑Mdivi-1可以抑制α-KG的作用。簡而言之,作者的研究結(jié)果提供了迄今為止未記錄的α-KG在維持軟骨穩(wěn)態(tài)中的作用證據(jù),表明它可以成為OA的潛在治療靶點(diǎn)和藥物。

 

 

 

實(shí)驗(yàn)方法

CCK-8、EdU檢測、流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)印跡、RT-qPCR、免疫組化、RNA測序、大鼠實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)

L. Liu, W. Zhang, T. Liu, Y. Tan, C. Chen, J. Zhao, H. Geng, C. Ma, The physiological metabolite α-ketoglutarate ameliorates osteoarthritis by regulating mitophagy and oxidative stress, Redox Biology 62 (2023).