OIP5-AS1的m6A修飾介導hnRNPA1泛素化和降解，促進胃癌的糖酵解、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移

       opa相互作用蛋白5反義轉(zhuǎn)錄物1 （OIP5-AS1）在胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。然而，OIP5-AS1的詳細分子機制尚未完全闡明。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1在胃癌組織和細胞系中特異性高表達，并與不良預后相關(guān)。OIP5-AS1的缺失抑制胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和糖酵解，而OIP5-AS1的異位表達則產(chǎn)生相反的影響。同時，敲低OIP5-AS1抑制了患者來源的異種移植模型的腫瘤生長，并抑制了腫瘤轉(zhuǎn)移。機制上，IGF2BP3通過OIP5-AS1上的N6 -甲基腺苷（m6A）修飾位點與OIP5-AS1結(jié)合，從而穩(wěn)定OIP5-AS1。此外，OIP5-AS1阻止Trim21介導的hnRNPA1泛素化降解，穩(wěn)定hnRNPA1蛋白，并通過調(diào)控PKM2信號通路促進胃癌惡性進展。該研究于2023年10月發(fā)表在《Gastric Cancer》，IF：7.4。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. OIP5 - AS1的高表達與胃癌患者的臨床指標密切相關(guān)

       初步分析GEPIA STAD數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)與癌旁非腫瘤組織相比，OIP5-AS1在胃癌組織中顯著升高（圖1A）。采用qRT-PCR檢測OIP5-AS1在90對胃癌及相應的癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1在腫瘤組織中的表達高于正常組織（圖1B）。檢測OIP5-AS1表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1與TNM階段、T階段和遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（圖1C-E）。在年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面未觀察到顯著差異（圖1E-G）。此外，Kaplan-Meier分析表明，與OIP5-AS1表達水平較低的患者相比，OIP5-AS1表達水平較高的患者總體生存率較差（圖1H）。與人正常胃黏膜細胞株GES-1相比，OIP5-AS1在胃癌細胞株（MGC-803、BGC-823、SGC-7901和AGS）中的表達水平顯著上調(diào)（圖1I），與臨床結(jié)果一致。最后，使用FISH和亞細胞分離實驗來驗證OIP5-AS1在胃癌細胞中是一個細胞質(zhì)lncRNA（圖1J， K）。

圖1. OIP5-AS1的高表達水平與胃癌患者的臨床參數(shù)密切相關(guān)

2. OIP5 - AS1加速體外細胞生長和集落形成以及體內(nèi)腫瘤形成

       為研究OIP5-AS1在GC細胞中的調(diào)控作用，使用慢病毒載體在MGC-803細胞中穩(wěn)定過表達OIP5-AS1，并在AGS細胞中使用兩個不同的shRNA序列穩(wěn)定沉默OIP5-AS1（圖2A）。CCK-8和EdU分析顯示，敲除OIP5-AS1顯著減弱細胞增殖能力，而過表達OIP5-AS1則促進細胞增殖（圖2B-D）。同樣，OIP5-AS1缺陷降低細胞的克隆形成能力，而OIP5-AS1過表達促進GC細胞的生長（圖2E，F(xiàn)）。此外，下調(diào)OIP5-AS1顯著降低Cyclin D1和CDK2的表達，同時增加p21和p27的表達，這在OIP5-AS1過表達細胞系中得到驗證（圖2G）。為驗證OIP5-AS1在體內(nèi)對胃癌腫瘤生長的影響，利用新鮮胃癌組織建立患者來源的異種移植模型，尾靜脈接種sh-OIP5-AS1或shNC慢病毒。沉默OIP5-AS1組產(chǎn)生的腫瘤體積和重量均顯著低于對照組（圖2H-K）。此外，IHC分析顯示，sh- OIP5-AS1處理組中增殖標志物PCNA的表達降低（圖2L）。此外，與對照組相比，OIP5-AS1被阻斷后，移植瘤中OIP5-AS1的表達明顯下調(diào)（圖2M）。

圖2. OIP5-AS1在體外促進細胞生長和集落形成，在體內(nèi)促進腫瘤形成

3. OIP5-AS1在體外促進胃癌細胞的遷移和侵襲，在體內(nèi)促進胃癌移植瘤的轉(zhuǎn)移

       隨后，通過劃痕實驗和transwell侵襲實驗來研究OIP5-AS1在胃癌細胞轉(zhuǎn)移行為中的作用。如圖3A所示，沉默OIP5-AS1的表達被顯著抑制，而強制OIP5-AS1的表達增強GC細胞的遷移能力。同樣，OIP5-AS1沉默細胞的侵襲速度明顯較慢，而OIP5-AS1過表達細胞的侵襲速度比相應對照細胞快（圖3B）。western blot結(jié)果顯示，沉默OIP5-AS1上調(diào)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白e -鈣黏蛋白（E-cadherin）表達，下調(diào)n-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和slug表達，但過表達OIP5-AS1具有相反的作用（圖3C）。為研究OIP5-AS1在體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，作者將熒光素酶標記的Ctrl-、OIP5-AS1-、sh-OIP5-AS1-或shNC轉(zhuǎn)染細胞注射到NOD-SCID小鼠的尾靜脈中。圖3D， E 顯示OIP5-AS1沉默組小鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移性生長顯著減少，而OIP5-AS1過表達組小鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移性生長顯著增加。

圖3. OIP5-AS1在體外促進胃癌細胞的遷移和侵襲，在體內(nèi)促進移植瘤的轉(zhuǎn)移

4. OIP5 - AS1調(diào)控胃癌細胞中的Warburg效應

       進行葡萄糖攝取、乳酸和海馬實驗檢測OIP5-AS1是否影響有氧糖酵解。正如預期的那樣，沉默OIP5-AS1的細胞顯示出葡萄糖攝取和乳酸生成的顯著下降。然而，過表達OIP5-AS1的細胞增加葡萄糖攝取和乳酸生成（圖4A，B）。此外，敲低OIP5-AS1抑制糖酵解和糖酵解能力，而OIP5-AS1過表達顯著增強GC細胞的糖酵解和糖酵解能力（圖4C）。OIP5-AS1敲低顯著增加ATP生成和最大呼吸，而強制表達OIP5-AS1可降低這些因子（圖4D）。采用糖酵解抑制劑2-脫氧葡萄糖（2-DG）評估OIP5-AS1是否通過調(diào)節(jié)有氧糖酵解影響細胞增殖和轉(zhuǎn)移。在CCK-8和Transwell侵襲實驗中，2-DG處理抑制OIP5-AS1敲除和OIP5-AS1過表達細胞的增殖和轉(zhuǎn)移（圖4E，F(xiàn)）。

圖4. OIP5-AS1調(diào)控GC細胞的Warburg效應

5. IGF2BP3以依賴m6A的方式調(diào)控OIP5 - AS1的表達

       在AGS細胞中，IGF2BP3直接與OIP5-AS1結(jié)合，如RNA下拉實驗所示（圖5A）。隨后的RIP實驗驗證IGF2BP3抗體在AGS細胞中對OIP5-AS1的富集，證實IGF2BP3與OIP5-AS1之間的相互作用（圖5B）。利用SRAMP（m6A修飾位點預測因子）預測OIP5-AS1序列中的經(jīng)典m6A基序（GAACT），從而推測OIP5-AS1在AGS細胞中可能存在m6A修飾。采用MeRIP實驗驗證OIP5-AS1中m6A修飾（圖5C）。此外，RNA pull-down實驗顯示，突變OIP5-AS1中的m6A基序后，IGF2BP3與OIP5-AS1的結(jié)合顯著下降，表明IGF2BP3與OIP5-AS1的結(jié)合依賴于m6A修飾（圖5D）。METTL3是一種重要的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，被稱為m6A writer，在胃癌組織中高表達，與患者的不良預后相關(guān)。因此，在GC細胞中敲低IGF2BP3或METTL3，以研究IGF2BP3是否調(diào)節(jié)OIP5-AS1的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)IGF2BP3的表達顯著降低（圖5E）。然后，使用轉(zhuǎn)錄抑制劑Actinomycin D處理來研究OIP5-AS1隨時間的穩(wěn)定性。IGF2BP3的沉默導致OIP5-AS1的穩(wěn)定性和半衰期明顯降低（圖5F）。同樣，METTL3的缺失顯著縮短OIP5-AS1的半衰期（圖5F）。與對照組相比，在使用IGF2BP3或m6A特異性抗體進行RIP檢測時，METTL3敲低顯著影響OIP5-AS1的富集（圖5G，H）。

圖5. IGF2BP3以依賴m6A的方式調(diào)控OIP5-AS1的表達

6. IGF2BP3通過OIP5?AS1調(diào)節(jié)GC細胞的生物活性

       將siIGF2BP3和OIP5-AS1慢病毒共轉(zhuǎn)染AGS細胞，探討IGF2BP3是否參與OIP5-AS1介導的胃癌細胞生物學功能。qRT-PCR結(jié)果表明，在GC細胞中過表達OIP5-AS1后，si-IGF2BP3轉(zhuǎn)染細胞中的OIP5-AS1表達水平部分升高（圖6A）。IGF2BP3敲低顯著抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，而這些作用可被OIP5-AS1上調(diào)逆轉(zhuǎn)（圖6B-G、7A、B）。此外，IGF2BP3沉默細胞中葡萄糖攝取、乳酸生成、糖酵解、糖酵解能力下降、ATP生成增加和最大呼吸作用可被OIP5-AS1過表達逆轉(zhuǎn)（圖7C-E）。這些結(jié)果表明，OIP5-AS1抑制劑部分介導IGF2BP3的癌基因效應。

圖6. IGF2BP3通過OIP5- AS1調(diào)節(jié)GC細胞的生物活性

圖7. IGF2BP3通過OIP5-AS1調(diào)控GC細胞侵襲、EMT和葡萄糖代謝

7. OIP5 - AS1通過阻斷Trim21介導的hnRNPA1泛素化和降解來增強hnRNPA1的穩(wěn)定性

       RNA pull-down和RIP實驗證實OIP5-AS1可能與hnRNPA1相互作用（圖8A，B）。根據(jù)截斷實驗，hnRNPA1與OIP5-AS1的0 ~ 500 nt片段結(jié)合（圖8C）。檢測敲低OIP5-AS1的AGS細胞和過表達OIP5-AS1的MGC-803細胞中hnRNPA1的表達水平，進一步闡明OIP5-AS1與hnRNPA1相互作用的分子機制。觀察到，在OIP5-AS1沉默和OIP5-AS1過表達的細胞中，hnRNPA1 mRNA水平保持不變（圖8D）。然而，在OIP5-AS1下調(diào)的細胞中，hnRNPA1蛋白水平顯著降低，而在OIP5-AS1上調(diào)的細胞中，hnRNPA1蛋白水平顯著升高（圖8E）。蛋白穩(wěn)定性實驗顯示，敲低OIP5-AS1可以顯著縮短GC細胞中hnRNPA1蛋白的半衰期，而過表達OIP5-AS1則顯著增加hnRNPA1蛋白的半衰期（圖8F，G）。此外，當使用蛋白酶體抑制劑MG132處理GC細胞時，OIP5-AS1沉默后hnRNPA1蛋白水平的下降被減弱，而OIP5-AS1過表達則有相反的效果（圖8H）。此外，OIP5-AS1敲低細胞的hnRNPA1泛素化水平增加，而OIP5-AS1過表達細胞的hnRNPA1泛素化水平降低（圖8I），表明OIP5-AS1參與胃癌細胞中hnRNPA1的蛋白酶體依賴性降解。此外，OIP5-AS1敲低增強PKM1的表達，同時降低PKM2的表達（圖8J）。相反，強制表達OIP5-AS1降低PKM1的表達，增加PKM2的表達（圖8J）。如圖8K所示，與GES-1細胞相比，GC細胞系中Trim21的表達水平低，hnRNPA1的表達水平高。此外，盡管OIP5-AS1的表達水平?jīng)]有顯著差異，但在Trim21過表達的細胞中，hnRNPA1的表達水平被下調(diào)（圖8L，M）。進行CO-IP檢測，觀察到在AGS細胞中，Trim21與hnRNPA1結(jié)合（圖8N）。此外，當OIP5-AS1被沉默或過表達時，檢測Trim21和hnRNPA1之間的關(guān)聯(lián)。OIP5-AS1的下調(diào)顯著改善，而OIP5-AS1的上調(diào)降低Trim21和hnRNPA1的相互作用（圖8O）。

圖8. OIP5-AS1通過阻斷Trim21介導的hnRNPA1泛素化和降解增強hnRNPA1的穩(wěn)定性

8. hnRNPA1介導胃癌細胞中OIP5-AS1的調(diào)控 

       為驗證OIP5-AS1是否影響HNRNPA1調(diào)控的胃癌細胞功能，進行挽救實驗。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，sh-OIP5- AS1下調(diào)的hnRNPA1和PKM2蛋白表達以及上調(diào)的PKM1蛋白表達可以被hnRNPA1過表達所逆轉(zhuǎn)（圖9A），但在hnRNPA1沉默后，OIP5-AS1過表達所誘導的hnRNPA1和PKM2蛋白表達增加以及PKM1蛋白表達降低被消除（圖11A）。hnRNPA1的強制表達部分恢復OIP5-AS1敲低介導的GC細胞生長、遷移和侵襲的抑制（圖9B-G，10A，B），而hnRNPA1的抑制部分逆轉(zhuǎn)OIP5-AS1上調(diào)誘導的GC細胞生長和轉(zhuǎn)移的促進作用（圖11B-G，12A，B）。此外，hnRNPA1的刺激恢復降低的葡萄糖攝取、乳酸生成、糖酵解和糖酵解能力。同時增強OIP5-AS1沉默引起的ATP生成和最大呼吸（圖10C-F）。然而，hnRNPA1下調(diào)消除OIP5-AS1過表達引起的葡萄糖攝取、乳酸生成、糖酵解和糖酵解能力升高，并降低ATP生成和最大呼吸（圖12C-F）。綜上所述，OIP5-AS1通過競爭性結(jié)合hnRNPA1發(fā)揮致癌作用。

圖9. hnRNPA1介導GC細胞中OIP5-AS1的調(diào)控

圖10. hnRNPA1介導OIP5-AS1對GC細胞侵襲、EMT和糖代謝的調(diào)節(jié)

圖11. 沉默hnRNPA1抑制OIP5- AS1對胃癌細胞生長和遷移的促進作用

圖12. 敲低hnRNPA1可逆轉(zhuǎn)OIP5-AS1對MGC823細胞侵襲、EMT和糖酵解的促進作用

結(jié)論

       綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)m6A修飾穩(wěn)定的OIP5-AS1通過抑制Trim21介導的HNRNPA1泛素化和降解促進胃癌進展，導致PKM2形成。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們對胃癌中IGF2BP3/OIP5-AS1/Trim21/hnRNPA1/PKM2軸的理解，并提示OIP5-AS1可能為胃癌的診斷和治療開辟一個潛在的新視角。

實驗方法

質(zhì)粒，慢病毒和轉(zhuǎn)染，細胞培養(yǎng)，qRT?PCR，WB，IHC和HE染色，CCK-8，EdU實驗，菌落形成，Transwell侵襲實驗，傷口愈合實驗，RIP，Co?IP，RNA pulldown和截斷實驗，RNA穩(wěn)定性測定，泛素化分析，MeRIP，葡萄糖攝取和乳酸測定，亞細胞RNA分離，細胞外酸化速率和耗氧量測定，患者來源的異種移植模型，體內(nèi)動物模型轉(zhuǎn)移實驗，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測定

參考文獻

Xie R, Liu L, Lu X, He C, Yao H, Li G. N6-methyladenosine modification of OIP5-AS1 promotes glycolysis, tumorigenesis, and metastasis of gastric cancer by inhibiting Trim21-mediated hnRNPA1 ubiquitination and degradation. Gastric Cancer. 2023 Oct 28. doi: 10.1007/s10120-023-01437-7. Epub ahead of print. PMID: 37897508.