FAM171B通過穩(wěn)定波形蛋白并增強CCL2介導(dǎo)的TAM浸潤促進膀胱癌進展
膀胱癌是世界范圍內(nèi)第二大常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。膀胱尿路上皮癌（BLCA）是膀胱癌最常見的病理類型，占所有膀胱癌的90%。侵襲和轉(zhuǎn)移是膀胱癌患者預(yù)后不良的主要原因。雖然非肌層浸潤性膀胱癌很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，但約有15-20%進展為肌層浸潤性膀胱癌。肌層浸潤性膀胱癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險高，5年生存率明顯低于非肌層浸潤性膀胱癌。免疫療法帶來了有希望的生存獲益，然而肌層浸潤性膀胱癌的治療仍然具有挑戰(zhàn)性，因其有較高的復(fù)發(fā)率。因此，深入了解膀胱癌進展的分子機制對于開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。
上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是驅(qū)動遠處轉(zhuǎn)移的主要機制，是膀胱癌患者死亡的主要原因。波形蛋白（VIM）是間充質(zhì)細胞的關(guān)鍵標(biāo)志物，在膀胱癌的生長、侵襲和不良預(yù)后相關(guān)。膀胱癌細胞EMT過程中波形蛋白表達上調(diào)，提示靶向波形蛋白有望成為阻止膀胱癌轉(zhuǎn)移進展的一種治療策略。腫瘤微環(huán)境（TME）由多種促進腫瘤進展的基質(zhì)細胞組成。這些細胞中腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）構(gòu)成了最豐富的免疫細胞群。TAMs是抗腫瘤免疫的主要障礙，是免疫治療失敗的關(guān)鍵因素。值得注意的是，趨化因子配體2（CCL2）在巨噬細胞募集中起關(guān)鍵作用，并參與癌細胞增殖、癌癥轉(zhuǎn)移和免疫抑制性TME的建立。了解CCL2在膀胱癌中持續(xù)表達的分子機制可以為開發(fā)有效的抗CCL2治療提供新的理論基礎(chǔ)。FAM171B是一種廣泛表達且進化保守的蛋白。在人結(jié)直腸癌細胞中，F(xiàn)AM171B被鑒定為miR-483-3p的功能靶點，參與調(diào)控奧沙利鉑耐藥。然而FAM171B的結(jié)構(gòu)、功能和在癌癥中的具體作用的理解仍然有限。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：12.658。
技術(shù)路線
主要研究結(jié)果
1. FAM171B表達與BLCA患者腫瘤進展及M2 TAM浸潤呈正相關(guān)
為了評估FAM171B在膀胱癌中的臨床意義，研究者利用TCGA數(shù)據(jù)庫、GEO數(shù)據(jù)庫和研究者的臨床中心的數(shù)據(jù)進行了全面的分析。首先，研究者分析了TCGA-BLCA隊列中19個腫瘤組織和匹配的癌旁組織的RNA測序數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM171B在BLCA腫瘤組織中的表達水平高于配對的癌旁組織（圖1A）。隨后，研究者對包含70例BLCA患者臨床標(biāo)本的組織微陣列進行免疫組織化學(xué)染色，以定量FAM171B蛋白表達。代表性圖像提供于圖1B中。根據(jù)從組織微陣列分析獲得的臨床信息和IHC染色結(jié)果，研究者確定了高FAM171B蛋白水平與晚期T分期和晚期N分期之間的顯著相關(guān)性（圖1C，D）。對TCGA數(shù)據(jù)庫中406例BLCA組織的RNA測序數(shù)據(jù)進行的分析獲得了一致的結(jié)果（圖1J-L）。這些結(jié)果提示，F(xiàn)AM171B表達水平升高與較晚期的臨床病理分級和分期相關(guān)。此外，研究者的預(yù)后分析表明，F(xiàn)AM171B蛋白水平升高的BLCA患者顯示出顯著較低的總生存（OS）率、無進展生存（PFS）率和疾病特異性生存（DSS）率（圖1E-G）。然而，無病生存(DFS)率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1H）。為了驗證FAM171B在膀胱癌中的表達與生存率之間的關(guān)系，研究者使用了來自GEO數(shù)據(jù)庫的613例患者的完整隊列。結(jié)果表明，在該隊列中，F(xiàn)AM171B蛋白水平升高與較差的OS結(jié)局顯著相關(guān)（圖1I）。此外，對TCGA-BLCA隊列中的免疫細胞浸潤進行的分析表明，F(xiàn)AM171B表達與巨噬細胞浸潤的相關(guān)性最強（圖1M）。研究者進一步研究了影響單核/巨噬細胞的趨化因子表達與FAM171B的關(guān)系。在評估的趨化因子中，只有CCL2與FAM171B具有統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性（圖1N）。對于FAM171B與BLCA中巨噬細胞表型之間的關(guān)聯(lián)，基于QUANTISEQ算法的免疫分析顯示FAM171B表達與M2型巨噬細胞之間存在顯著的正相關(guān)（圖1P），而與M1型巨噬細胞之間沒有顯著的相關(guān)性（圖10）。在組織芯片中評估FAM171B與基質(zhì)細胞浸潤的關(guān)系。代表性圖像如圖1Q所示。根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，將所有樣本分為FAM171B高表達組和低表達組。通過多次免疫熒光分析，研究者發(fā)現(xiàn)FAM171B蛋白的表達水平與CD206+ M2巨噬細胞的浸潤顯著正相關(guān)，而與CD8+ T細胞的浸潤呈負相關(guān)。然而，在α-SMA+成纖維細胞浸潤方面，研究者沒有檢測到FAM171B高表達組和低表達組之間的顯著差異（圖1R）。綜上所述，研究者的研究結(jié)果表明，F(xiàn)AM171B與M2型巨噬細胞的浸潤相關(guān)，并可能作為膀胱癌的潛在預(yù)后指標(biāo)。
圖1 FAM171B表達與BLCA患者腫瘤進展及M2 TAM浸潤呈正相關(guān)
2. FAM171B促進膀胱癌細胞的惡性表型
Chronos依賴性評分顯示，在CCLE數(shù)據(jù)庫中28個人膀胱尿路上皮癌細胞系中，T24細胞系的評分最低，表明FAM171B在T24細胞中比在其他細胞系中更關(guān)鍵（圖2A）。除T24人膀胱尿路上皮癌細胞外，研究者還納入了MB49小鼠膀胱尿路上皮癌細胞。為了研究FAM171B在膀胱癌細胞中的分子功能，研究者在T24和MB49細胞中敲低和過表達FAM171B，并通過Western blot分析驗證其效率（圖2B）。CCK-8法檢測FAM171B對T24和MB49細胞活力的影響。兩個細胞系的結(jié)果表明，在96 h后，F(xiàn)AM171B過表達細胞的活力增加，而FAM171B敲低細胞的活力降低（圖2E）。此外，集落形成實驗結(jié)果表明，過表達FAM171B后，T24和MB49細胞的集落形成能力顯著增加，而敲低FAM171B導(dǎo)致集落形成能力下降（圖2C，D）。這些體外研究結(jié)果表明，F(xiàn)AM171B基因的表達影響細胞增殖，盡管細胞活力的差異僅在96小時后才變得有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，研究者的目的是通過傷口愈合和transwell侵襲來闡明FAM171B對膀胱癌細胞轉(zhuǎn)移的影響。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，與相應(yīng)的對照組相比，敲低FAM171B的T24和MB49細胞組中下室的遷移細胞數(shù)量減少，而過表達FAM171B時，下室的遷移細胞數(shù)量增加（圖2F，G）。同樣，敲低FAM171B降低了T24和MB49細胞的傷口愈合效果。而FAM171B過表達顯著加速了細胞遷移（圖2H，I）。這些體外結(jié)果強烈表明FAM171B促進了膀胱癌細胞的惡性表型。
圖2 FAM171B促進膀胱癌細胞的惡性表型
3. RNA測序T24細胞以研究FAM171B的功能
為了研究FAM171B在膀胱癌細胞中的作用，研究者對FAM171B過表達和對照T24細胞進行了RNA測序。樣本間相關(guān)性的熱圖表明，F(xiàn)AM171B過表達組和對照組之間的mRNA表達水平存在顯著差異，而各組內(nèi)的差異相對較?。▓D3A）。通過對測序數(shù)據(jù)的分析，研究者確定了244個差異表達基因?；鹕綀D顯示了一些差異表達的基因；上調(diào)基因包括CDRT4、APLN和CCL2，下調(diào)基因包括RAB4B、CACNA1S和IL1A（圖3B）。此外，6個樣本的基因表達熱圖顯示，亞組間差異表達基因的表達存在顯著差異（圖3C）。為了進一步了解FAM171B在T24細胞中的具體功能，研究者進行了GO分析，KEGG分析和eggNOG分析。在T24細胞系中，GO分析顯示FAM171B與炎癥反應(yīng)和細胞因子介導(dǎo)的信號通路等生物學(xué)過程顯著相關(guān)（圖3D）。在細胞成分類別中，F(xiàn)AM171B與細胞外間隙和過時的細胞外區(qū)域部分顯著相關(guān)（圖3E）。在分子功能方面，F(xiàn)AM171B與腫瘤壞死因子激活受體活性和細胞因子活性顯著相關(guān)（圖3F）。KEGG分析表明，F(xiàn)AM171B主要與IL-17信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用和TNF信號通路相關(guān)（圖3G）。此外，eggNOG功能分析顯示FAM171B主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制、復(fù)制、重組、修復(fù)和細胞骨架相關(guān)功能（圖3H）。綜上所述，RNA測序的結(jié)果全面揭示了FAM171B在人膀胱癌T24細胞系中的不同功能，表明其功能主要涉及細胞因子，信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞骨架相關(guān)過程。
圖3 RNA測序T24細胞以研究FAM171B的功能
4. 膀胱癌細胞中FAM171B與波形蛋白、HNRNPU相互作用
為了闡明FAM171B在蛋白質(zhì)水平上的分子作用，研究者通過免疫共沉淀和質(zhì)譜鑒定了膀胱癌細胞中FAM171B的主要相互作用蛋白。使用DYKDDDDK磁珠從過表達標(biāo)記FAM171B的T24細胞和對照細胞中收集含有FAM171B相互作用蛋白的上清液。隨后，利用質(zhì)譜鑒定出特定的正相互作用蛋白（圖4A，B）。質(zhì)譜鑒定出得分最高的相互作用蛋白如圖4C所示。利用STRING數(shù)據(jù)庫獲得FAM171B與其相互作用蛋白之間的相互作用。隨后構(gòu)建FAM171B的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖4D所示。其中評分最高的VIM和HNRNPU被鑒定為T24細胞中與FAM171B相互作用的關(guān)鍵蛋白。人類FAM171B蛋白的預(yù)測結(jié)構(gòu)來自AlphaFold網(wǎng)站（圖4E）。為了進一步探索蛋白質(zhì)之間的相互作用，研究者進行了模擬，以可視化FAM171B與波形蛋白和HNRNPU的對接模式（圖4J，L）。免疫熒光結(jié)果顯示FAM171B蛋白在T24細胞的細胞質(zhì)和細胞核中均有表達（圖4F）。免疫熒光雙標(biāo)染色和共定位分析驗證FAM171B與波形蛋白/HNRNPU的相互作用。雙重免疫熒光染色結(jié)果表明，F(xiàn)AM171B-波形蛋白復(fù)合體主要定位于細胞質(zhì)（圖4G），而FAM171B- HNRNPU復(fù)合體主要定位于細胞核（圖4H）。Image J軟件共定位分析證實FAM171B與波形蛋白和HNRNPU存在空間共表達（圖4J，K）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了波形蛋白和HNRNPU是膀胱癌細胞中FAM171B的主要相互作用蛋白。
圖4 膀胱癌細胞中FAM171B與波形蛋白、HNRNPU相互作用
5. FAM171B通過穩(wěn)定波形蛋白促進膀胱癌的進展
波形蛋白是EMT的蛋白標(biāo)記物，EMT是癌細胞獲得遷移和侵襲表型的過程。因此，研究者檢測了FAM171B對T24細胞EMT過程的影響。研究者觀察到FAM171B過表達的細胞中波形蛋白水平明顯升高，而FAM171B敲低的細胞中波形蛋白水平較對照組細胞降低。然而，在FAM171B過表達或敲低的T24細胞中，e-鈣黏蛋白和n-鈣黏蛋白的表達沒有顯著變化（圖5A）。此外，通過對組織芯片樣本的免疫組織化學(xué)染色分析，研究者發(fā)現(xiàn)FAM171B和波形蛋白的蛋白水平呈正相關(guān)（圖5K，L）。之前的結(jié)果表明FAM171B和波形蛋白在膀胱癌細胞中存在相互作用。蛋白質(zhì)印跡分析表明，過表達FAM171B后的波形蛋白水平增加，可以通過Vimentin-IN-1（一種誘導(dǎo)波形蛋白降解的波形蛋白抑制劑）處理逆轉(zhuǎn)（圖5B）。為了研究FAM171B是否通過vimentin增強膀胱癌細胞的侵襲和遷移，研究者用Vimentin-IN-1處理細胞，進行劃痕實驗和transwell侵襲實驗。Transwell侵襲實驗結(jié)果表明，Vimentin-IN-1部分抑制了FAM171B過表達引起的T24細胞侵襲能力的增加（圖5C，D）。同樣，劃痕實驗結(jié)果表明，Vimentin-IN-1處理降低了FAM171B過表達引起的T24細胞遷移率的增加（圖5E，F(xiàn)）。鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果表明，高效過表達FAM171B導(dǎo)致膀胱癌細胞的形態(tài)發(fā)生變化，從上皮形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)形態(tài)（圖5G）。接下來，研究者使用CHX抑制膀胱癌細胞的蛋白質(zhì)合成，隨后通過蛋白質(zhì)印跡法檢測剩余的波形蛋白的水平。CHX處理10 h后，F(xiàn)AM171b過表達細胞的波形蛋白水平高于對照細胞（圖5H）。經(jīng)過分析，研究者觀察到過表達FAM171B使內(nèi)源性波形蛋白的半衰期從6 h延長到9 h，表明FAM171B可以穩(wěn)定波形蛋白（圖5I）。隨后，研究者研究了FAM171B是否影響T24細胞中波形蛋白的泛素化。結(jié)果表明，F(xiàn)AM171B過表達導(dǎo)致波形蛋白泛素化水平降低，而FAM171B敲低導(dǎo)致泛素化水平升高（圖5J）。為了進一步驗證FAM171B/波形蛋白在體內(nèi)的作用，研究者使用T24細胞建立了小鼠皮下異種移植模型（圖5M）。小鼠異種移植瘤的IHC染色分析表明，在OE-FAM171B組中FAM171B的表達顯著增加，證實了模型的成功建立（圖5N，R）。此外，F(xiàn)AM171B上調(diào)了體內(nèi)波形蛋白的表達，這一作用被Vimentin-IN-1處理逆轉(zhuǎn)，與體外研究結(jié)果相似（圖5N，S）。而Vimentin-IN-1處理可有效緩解這一效應(yīng)（圖5O，P）。此外，在小鼠體重方面，Vimentin-IN-1處理可部分緩解FAM171B過表達導(dǎo)致的體重下降（圖5Q）。綜上所述，這些結(jié)果證實了FAM171B在體內(nèi)外通過穩(wěn)定波形蛋白促進膀胱癌的進展。
圖5 FAM171B通過穩(wěn)定波形蛋白促進膀胱癌的進展
6. FAM171B通過HNRNPU調(diào)控CCL2，促進膀胱癌中TAM的遷移和浸潤
研究者進行體內(nèi)和體外實驗，研究FAM171B和HNRNPU對膀胱癌細胞CCL2表達的影響。ELISA結(jié)果顯示，在MB49小鼠膀胱癌細胞中，過表達FAM171B增加了CCL2的分泌，敲低FAM171B減少了CCL2的分泌（圖6A）。RIP實驗結(jié)果證實了MB49細胞中HNRNPU與CCL2前體RNA的結(jié)合（圖6B）。與之前的研究結(jié)果一致，在MB49細胞中敲低HNRNPU可以增加CCL2前體RNA的水平并降低CCL2 RNA的水平（圖6C）。ELISA結(jié)果也證實，敲低HNRNPU降低了MB49細胞中CCL2的分泌（圖6D）。為了研究FAM171B和HNRNPU是通過共同途徑還是不同途徑影響CCL2分泌，研究者在FAM171B過表達的MB49細胞中分別進行了HNRNPU敲低干預(yù)或CCR2抑制劑處理（圖6E）。ELISA結(jié)果顯示，敲低HNRNPU減弱了FAM171B過表達引起的CCL2分泌增加（圖6F）。CCL2是誘導(dǎo)單核細胞和巨噬細胞特異性趨化的眾所周知的趨化因子。為了探討FAM171B和HNRNPU對巨噬細胞趨化的影響，研究者將RAW264.7小鼠巨噬細胞與不同分組的MB49小鼠膀胱癌細胞共培養(yǎng)。趨化實驗結(jié)果表明，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，F(xiàn)AM171B過表達增強了巨噬細胞對腫瘤細胞的趨化，而HNRNPU敲低和CCR2抑制部分減弱了這一作用（圖6G，H）。為了進一步驗證FAM171B/CCL2調(diào)控在體內(nèi)的作用，研究者使用MB49膀胱癌細胞建立了小鼠皮下移植瘤模型（圖6I）。免疫組化分析（圖6J，O）和流式細胞術(shù)（圖6K，P）結(jié)果證實，F(xiàn)AM171B過表達顯著增加了腫瘤組織中的巨噬細胞浸潤，而CCR2抑制劑治療有效抑制了這一作用。重要的是，CCR2抑制劑還部分逆轉(zhuǎn)了FAM171B過表達引起的腫瘤生長增加（圖6L，M），并減輕了體重減輕（圖6N）。綜上所述，這些實驗表明FAM171B通過HNRNPU促進CCL2分泌，從而導(dǎo)致巨噬細胞浸潤和腫瘤進展。
圖6 FAM171B通過HNRNPU調(diào)控CCL2，促進膀胱癌中TAM的遷移和浸潤
7. FAM171B通過調(diào)控CCL2的表達增強TAM向M2表型的極化
研究者使用雙重免疫熒光染色和流式細胞術(shù)在體內(nèi)和體外研究FAM171B/CCL2調(diào)節(jié)對膀胱癌相關(guān)巨噬細胞極化的影響。流式細胞術(shù)分析顯示，與對照組相比，與過表達FAM171b的MB49細胞共培養(yǎng)時，CD206陽性的RAW264.7巨噬細胞比例增加。敲低HNRNPU和CCR2抑制劑的處理部分逆轉(zhuǎn)了FAM171B過表達誘導(dǎo)的CD206陽性的增加（圖7A，B）。在IHC中，研究者使用了另一種M2巨噬細胞標(biāo)志物Arg1，并獲得了類似的結(jié)果（圖7C，D）。此外，研究者觀察到在共培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)基中，EGF和IL-10的分泌顯著增加，這兩種標(biāo)志物都是M2巨噬細胞的標(biāo)志物。有趣的是，THP-1來源的巨噬細胞與過表達FAM171b的T24細胞共培養(yǎng)后，其聚集性增強。為了進一步驗證FAM171B和CCL2在體內(nèi)的作用，研究者檢測了小鼠移植瘤中M2型巨噬細胞的比例。與體外實驗結(jié)果一致，小鼠FAM171B過表達組皮下腫瘤中M2型巨噬細胞的比例增加，CCR2抑制劑處理顯著逆轉(zhuǎn)了FAM171B過表達的這一作用（圖7G-J）。綜上所述，這些實驗結(jié)果證實了FAM171B具有通過CCL2通路促進TME中TAM的M2極化的能力。
圖7 FAM171B通過調(diào)控CCL2的表達增強TAM向M2表型的極化
結(jié)論
研究者發(fā)現(xiàn)FAM171B是一個有效的促進膀胱癌進展的因子，并且與晚期癌癥分期和不良預(yù)后呈正相關(guān)。此外，F(xiàn)AM171B通過與波形蛋白相互作用，增強其穩(wěn)定性，發(fā)揮穩(wěn)定作用，導(dǎo)致腫瘤進展。此外，F(xiàn)AM171B通過與HNRNPU相互作用增強CCL2 mRNA的剪接，最終導(dǎo)致TAM的募集并向M2表型極化?；谘芯空叩木C合研究結(jié)果，F(xiàn)AM171B作為膀胱癌診斷和治療干預(yù)的生物標(biāo)志物具有巨大的潛力。
機制圖
實驗方法
TCGA和GEO數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，細胞培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染，細胞增殖測定和集落形成測定，鬼筆環(huán)肽染色，RNA 免疫沉淀（RIP），qRT-PCR，蛋白質(zhì)印跡，免疫熒光染色（IF），免疫組織化學(xué)染色（IHC），HE染色，免疫共沉淀，流式細胞術(shù)，ELISA，傷口愈合試驗，transwell侵襲試驗，RNA測序、數(shù)據(jù)處理和基因差異分析，動物實驗，小鼠異種移植腫瘤模型
參考文獻
Hu WM, Li M, Ning JZ, Tang YQ, Song TB, Li LZ, Zou F, Cheng F, Yu WM. FAM171B stabilizes vimentin and enhances CCL2-mediated TAM infiltration to promote bladder cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Nov 2;42(1):290. doi: 10.1186/s13046-023-02860-5.