小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)抗腫瘤免疫并抑制乳腺癌腦轉(zhuǎn)移

摘要

       乳腺癌腦轉(zhuǎn)移（BCBM）是一種致命的疾病，沒有有效的治療方法。先前的研究表明，腦癌和轉(zhuǎn)移瘤密集地浸潤著抗炎、促腫瘤的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，但大腦駐留小膠質(zhì)細(xì)胞的作用仍然存在爭議，因?yàn)樗鼈兒茈y與其他腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞區(qū)分開來。利用單細(xì)胞 RNA 測序、遺傳和人源化小鼠模型，我們專門鑒定了小膠質(zhì)細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)它們在 BCBM 中發(fā)揮著獨(dú)特的促炎癥和腫瘤抑制作用。缺乏小膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)物表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移增加、存活率降低以及自然殺傷細(xì)胞和 T 細(xì)胞反應(yīng)減少，這表明小膠質(zhì)細(xì)胞對于促進(jìn)抗腫瘤免疫以抑制 BCBM 至關(guān)重要。我們發(fā)現(xiàn)促炎癥反應(yīng)在人類小膠質(zhì)細(xì)胞中是保守的，并且其反應(yīng)標(biāo)志物與 BCBM 患者更好的預(yù)后相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)確立了小膠質(zhì)細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的重要作用，并強(qiáng)調(diào)它們作為腦轉(zhuǎn)移的潛在免疫治療靶點(diǎn)。

       該研究于2023年11月發(fā)表在《Nature cell biology》，IF：21.3。

技術(shù)路線

結(jié)果

1、BCBM 中 TAMs 的單細(xì)胞分析

       我們使用 scRNA-seq 通過 MDA-MB-231-BR (231BR) 模型來測試小膠質(zhì)細(xì)胞對 BCBM 的反應(yīng)。在此模型中，綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的231BR細(xì)胞通過心內(nèi)注射遞送至動(dòng)脈循環(huán)，并在第28天形成實(shí)質(zhì)腦轉(zhuǎn)移（圖1a，b）。與人類 BCBM 一樣，轉(zhuǎn)移灶被離子化鈣結(jié)合接頭分子 1 (IBA1+) TAMs 高度浸潤（圖 1b、c）。對于 scRNA-seq，從對照和腦轉(zhuǎn)移分離細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)分離髓系細(xì)胞（圖 1d）。將癌細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞作為對照（圖 1d）。對通過質(zhì)量控制過濾的 42,891 個(gè)細(xì)胞的分析揭示了由經(jīng)典的marker識(shí)別的七種不同的細(xì)胞類型（圖 1e、f）。這包括目標(biāo)細(xì)胞類型：星形膠質(zhì)細(xì)胞（Aldoc 和 Atp1a2）、小膠質(zhì)細(xì)胞（Tmem119 和 P2ry12）和非小膠質(zhì)細(xì)胞髓系細(xì)胞（Lyz2 和 Plac8）（圖 1e、f）。我們還回收了少量室管膜細(xì)胞（Ccdc153和Rarres2）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（Mbp和Ptgds）、血管細(xì)胞（Cldn5和Vtn）和淋巴細(xì)胞（Cd3g和Gzma）（圖1e、f）。淋巴細(xì)胞和非小膠質(zhì)髓系細(xì)胞群優(yōu)先來自轉(zhuǎn)移狀態(tài)，表明這些細(xì)胞是從外周招募的。我們發(fā)現(xiàn)對照和腦轉(zhuǎn)移的星形膠質(zhì)細(xì)胞聚類差異有限。

圖1| BCBM 中 TAMs 的單細(xì)胞分析。

2、小膠質(zhì)細(xì)胞對 BCBM 表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促炎癥反應(yīng)

       與星形膠質(zhì)細(xì)胞相反，對髓系細(xì)胞的分析揭示了對照和轉(zhuǎn)移條件的強(qiáng)烈分離（圖2a）。通過由 Bowman 等人 (2016) 開發(fā)的特征，對每個(gè)細(xì)胞的核心小膠質(zhì)細(xì)胞特征進(jìn)行評(píng)分，將小膠質(zhì)細(xì)胞與其他髓系細(xì)胞群區(qū)分開來（圖 2b）。這確定了兩個(gè)大的小膠質(zhì)細(xì)胞群體（Tmem119、P2ry12、Sparc 和 Gpr34），其中一個(gè)包含來自對照和腦轉(zhuǎn)移的小膠質(zhì)細(xì)胞，另一個(gè)幾乎完全來自腦轉(zhuǎn)移（圖 2a、b）。我們還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞群體，它們的應(yīng)激反應(yīng)增加，這是組織操作后常見的。還鑒定出中性粒細(xì)胞（Camp 和 S100a9）、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（Ly6c2 和 Lyz2）、成熟樹突細(xì)胞（Ccr7 和 Flt3）和 B 細(xì)胞（Igkc 和 Cd79a）（圖 2b)。

       對小膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步分析揭示了 BCBM 的劇烈變化。我們鑒定了對照和腦轉(zhuǎn)移小膠質(zhì)細(xì)胞之間差異表達(dá)的 3,715 個(gè)基因?；虮倔w論 (GO) 分析表明，最上調(diào)的途徑與促炎癥反應(yīng)相關(guān)，例如“細(xì)胞因子產(chǎn)生”、“抗原加工和呈遞”和“對 IFN-β 的反應(yīng)”（圖 2c）。進(jìn)一步的分析表明，并非所有小膠質(zhì)細(xì)胞都一致上調(diào)這些程序。我們使用了一種稱為潛在狄利克雷分配（LDA）的概率聚類方法，也稱為主題建模，來評(píng)估小膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性（圖2d）。與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞聚類方法不同，主題建模將每個(gè)細(xì)胞分配給多個(gè)基因模塊或主題，這可以更好地了解不同但重疊的基因模塊在細(xì)胞群體中的表達(dá)方式。該分析確定了四個(gè)核心主題。主題 12 是最廣泛上調(diào)的，代表干擾素 (IFN) 反應(yīng)程序（Bst2、Ifitm3、Ifit3b 和 Isg15），此前已在其他疾病背景下小膠質(zhì)細(xì)胞報(bào)道過該程序（圖 2e-g）。這可能代表了小膠質(zhì)細(xì)胞對轉(zhuǎn)移性浸潤和組織損傷的最初感知。主題 15 顯示出更受限的表達(dá)模式，并且富含與抗原呈遞 (AP) 相關(guān)的基因（Cd74、H2-Aa 和 H2-D1）（圖 2e-g），這也在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和阿爾茨海默病中觀察到。 AP 基因使 AP 能夠作用于 T 細(xì)胞，這就提出了小膠質(zhì)細(xì)胞是否向中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的 T 細(xì)胞呈遞抗原的問題。主題 14 由一小部分小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，并與分泌表型相關(guān)（圖 2e-g）。該主題富集了與外泌體（Cd63）、脂質(zhì)代謝（Apoe 和 Lpl）和細(xì)胞因子（Spp1、Csf1、Il1b 和 Tnf）相關(guān)的基因（圖 2e，g）。這個(gè)主題與疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞或“DAM”的特征強(qiáng)烈重疊，“DAM”是在神經(jīng)退行性變中發(fā)現(xiàn)的一群吞噬細(xì)胞小膠質(zhì)細(xì)胞。 IFN 反應(yīng)和 AP 主題均包括編碼多種免疫細(xì)胞運(yùn)輸趨化因子的基因（圖 2e、g）。最后一個(gè)主題（主題 3）富含核糖體基因，這可能表明細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄能力或應(yīng)激反應(yīng)增加。這些數(shù)據(jù)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)多種促炎癥程序，表明它們在 BCBM 的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著不同的作用。

圖2|小膠質(zhì)細(xì)胞對 BCBM 表現(xiàn)出強(qiáng)烈的促炎癥反應(yīng)

3、小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)在不同的 BCBM 模型中是保守的

       我們通過流式細(xì)胞術(shù)、原位免疫熒光（IF）和細(xì)胞因子陣列在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了小膠質(zhì)細(xì)胞促炎癥反應(yīng)。我們通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了三個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志物：骨髓基質(zhì)抗原 2 (BST2)、主要組織相容性復(fù)合物 II (MHC-II) 和 CD74 。我們發(fā)現(xiàn)每個(gè)標(biāo)記的表達(dá)增加在五種不同的 BCBM 模型中是保守的（圖 3a），顯示小膠質(zhì)細(xì)胞對轉(zhuǎn)移的保守性。

       我們使用多重 IF 系統(tǒng)（索引聯(lián)合檢測，CODEX）進(jìn)行原位驗(yàn)證。我們對 MHC-II、CD74 和 IFN 刺激基因 15 (ISG15) 以及 TMEM119 和 GFP 進(jìn)行共染色，以分別識(shí)別小膠質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)促炎性小膠質(zhì)細(xì)胞位于腫瘤細(xì)胞的近端，而遠(yuǎn)端小膠質(zhì)細(xì)胞呈陰性（圖3b，c）。小膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)所有三種標(biāo)記的頻率最高（MHC-II+ CD74+ ISG15+，29%）（圖3c）。我們還觀察到僅表達(dá) AP 標(biāo)記物（MHC-II+ CD74+ ISG15?，11%）或 IFN 反應(yīng)標(biāo)記物（MHC-II? CD74? ISG15+，11%）的小膠質(zhì)細(xì)胞亞群（圖 3c）。這些數(shù)據(jù)與我們的主題模型一致，顯示出明顯的標(biāo)記重疊，但 AP 和 IFN 反應(yīng)程序?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞的不同子集具有顯著的排他性。

       我們使用細(xì)胞因子陣列研究了小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎功能。與我們的 scRNA-seq 一致，我們發(fā)現(xiàn)來自腫瘤大腦的小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)多種促炎細(xì)胞因子，包括巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (CSF1)、趨化因子配體 5 (CCL5)、趨化因子配體 9 (CXCL9) 和趨化因子配體 10 （CXCL10）（圖3d）?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)在蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證了我們的 scRNA-seq 結(jié)果，并證明小膠質(zhì)細(xì)胞對 BCBM 表現(xiàn)出促炎癥反應(yīng)。

圖3|小膠質(zhì)細(xì)胞促炎癥反應(yīng)在不同的 BCBM 模型中是保守的

4、缺乏小膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)物顯示腫瘤進(jìn)展加快

       先前的工作確定了 TAMs 在腦癌和轉(zhuǎn)移中的促腫瘤作用。這些研究主要利用 CSF1R 抑制劑和針對小膠質(zhì)細(xì)胞和其他類型 TAMs1 的 CX3CR1 靶向基因消融策略。最近開發(fā)了一種遺傳模型，由于 Csf1r 基因座中稱為 fms 內(nèi)含子調(diào)節(jié)元件 (FIRE) 的關(guān)鍵超級(jí)增強(qiáng)子的缺失，該模型特別缺乏小膠質(zhì)細(xì)胞（圖 4a）。Csf1rΔFIRE/ΔFIRE（FIRE-敲除(KO)）模型缺乏小膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)保留了大多數(shù)大腦駐留巨噬細(xì)胞和骨髓來源的髓系細(xì)胞，我們通過流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)了這一點(diǎn)（圖 4b）。我們通過比較 FIRE 野生型 (WT) 和 FIRE-KO 動(dòng)物的腫瘤進(jìn)展，研究了小膠質(zhì)細(xì)胞在 BCBM 中的作用。給小鼠注射 GFP 和熒光素酶標(biāo)記的 EO771 細(xì)胞，并通過體內(nèi)生物發(fā)光 (IVIS) 進(jìn)行監(jiān)測（圖 4c）。令人驚訝的是，許多 FIRE-KO 小鼠很快出現(xiàn)了晚期疾病的明顯臨床癥狀（圖 4d，e）。 14 只 FIRE-KO 小鼠中有 5 只在終點(diǎn)前死亡（死亡率為 36%），而所有 19 只 FIRE-WT 小鼠均存活（死亡率為 0%）（圖 4d）。與 FIRE-WT 相比，存活的 FIRE-KO 小鼠的體重也減少了 20% 以上，表明發(fā)病率增加（圖 4e）。 IVIS 成像揭示了腫瘤生長動(dòng)力學(xué)隨時(shí)間的變化。我們在 19 只 FIRE-WT 小鼠中的 8 只中觀察到腫瘤抑制，而所有 14 只 FIRE-KO 動(dòng)物中的信號(hào)持續(xù)增加（圖 4f）。我們使用連續(xù)稀釋方法進(jìn)一步比較了 FIRE-KO 和 FIRE-WT 小鼠的腫瘤移植情況。這表明與 FIRE-WT 小鼠相比，F(xiàn)IRE-KO 小鼠的移植效率更高，腫瘤生長更大?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，缺乏小膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)物表現(xiàn)出腫瘤生長和植入增加，以及腫瘤抑制能力下降。

圖4|缺乏小膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)物表現(xiàn)出腫瘤抑制能力降低

5、小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn) NK 和 T 細(xì)胞對 BCBM 的反應(yīng)

       鑒于我們在 FIRE-KO 小鼠中觀察到腫瘤抑制減少，我們假設(shè)小膠質(zhì)細(xì)胞通過 T 細(xì)胞促進(jìn)腫瘤抑制。我們通過確定 FIRE-KO 小鼠是否表現(xiàn)出對 BCBM 的 T 細(xì)胞反應(yīng)減弱來檢驗(yàn)這一假設(shè)。我們將 EO771 細(xì)胞注射到 FIRE-WT 和 FIRE-KO 動(dòng)物中，并在第 7 天開始觀察腫瘤抑制時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)比較大腦中 NK、T 和骨髓細(xì)胞群的數(shù)量和頻率（圖 5a）。盡管離體分析顯示此時(shí)腫瘤大小沒有顯著差異，但 FIRE-KO 小鼠所有 T 細(xì)胞亞群的數(shù)量和頻率均減少，包括 CD4+、CD8+ 和 T 調(diào)節(jié)性 (Treg) 細(xì)胞（圖 5b,c)。 FIRE-KO 動(dòng)物中 NK 和 NKT 細(xì)胞幾乎完全不存在（圖 5b、c）。功能標(biāo)記物分析顯示 FIRE-KO 中 CD8+ 和 CD4+ 效應(yīng)器以及中央記憶 T 細(xì)胞的數(shù)量持續(xù)減少。我們還發(fā)現(xiàn) FIRE-KO 中脫粒 CD107a+ NK 和 CD8+ 細(xì)胞的數(shù)量顯著減少（圖 5d）。 CD11b+ Ly6c+ 單核細(xì)胞的分析顯示 FIRE-WT 和 FIRE-KO 之間的數(shù)量沒有顯著差異。進(jìn)一步分析表明，F(xiàn)IRE-WT 中 CD8+ T 細(xì)胞頻率與 Tregs 呈負(fù)相關(guān)，但在 FIRE-KO 中呈正相關(guān)。這意味著，在 FIRE-WT 中，具有較多 CD8+ T 細(xì)胞的小鼠具有較少的 Tregs，而在 FIRE-KO 中，具有較多 CD8+ T 細(xì)胞的小鼠也具有較多的 Tregs。因此，在沒有小膠質(zhì)細(xì)胞的情況下，CD8+ T 細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤抑制的效果可能較差，因?yàn)榇嬖谙鄬^多的免疫抑制性 Tregs?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞通過支持 NK、NKT 和 T 細(xì)胞對 BCBM 的反應(yīng)來促進(jìn)抗腫瘤免疫微環(huán)境。

圖5|小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn) NK 和 T 細(xì)胞對 BCBM 的反應(yīng)

6、小膠質(zhì)細(xì)胞和 T 細(xì)胞協(xié)調(diào)抗腫瘤反應(yīng)

       我們通過評(píng)估缺乏 T 細(xì)胞的 FIRE-WT 動(dòng)物的腫瘤生長，進(jìn)一步研究了小膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤抑制作用是否是通過 T 細(xì)胞介導(dǎo)的。我們使用兩種方法來靶向T細(xì)胞，用S1P抑制劑（FTY720）治療（阻止T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)紺NS），以及缺乏T細(xì)胞的RAG1-KO小鼠（圖6a）。首先在第 0 天給動(dòng)物注射 EO771 細(xì)胞。從第 0 天開始每天注射 FTY720 和載體，直到第 12 天結(jié)束。流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)使用這兩種方法都可以消除大腦中的 T 細(xì)胞（圖 6b）。小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞的頻率在各組之間沒有顯著差異。在FTY720和RAG1-KO組中，我們發(fā)現(xiàn)相對于對照動(dòng)物，腫瘤植入和腫瘤負(fù)荷增加（圖6c、d）。這表明，在沒有 T 細(xì)胞的情況下，充滿小膠質(zhì)細(xì)胞的動(dòng)物抑制 BCBM 的能力較差，這表明小膠質(zhì)細(xì)胞至少部分通過支持 T 細(xì)胞反應(yīng)來抑制 BCBM。

       我們還發(fā)現(xiàn) WT 和 T 細(xì)胞缺陷動(dòng)物之間小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)存在有趣的差異。 FTY720 處理小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞顯示 AP 標(biāo)記物 MHC-II+ 和 CD74+ 的百分比分別降低了 3.1 倍和 1.6 倍（圖 6e）。這些蛋白質(zhì)的表達(dá)減少在 RAG1-KO 小鼠中更為明顯（圖 6e），表明這不僅僅是 FTY720 治療的效果。此外，F(xiàn)TY720處理的小鼠和RAG1-KO小鼠的IFN反應(yīng)蛋白BST2陽性小膠質(zhì)細(xì)胞的百分比分別是2倍和9.4倍（圖6e）。這表明T細(xì)胞可能需要完全許可小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào) AP 程序，如果沒有 T 細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞僅限于 IFN 反應(yīng)程序。

圖6|小膠質(zhì)細(xì)胞和 T 細(xì)胞協(xié)調(diào)抗腫瘤反應(yīng)

7、缺乏 T 細(xì)胞的動(dòng)物中小膠質(zhì)細(xì)胞活化的改變

       我們使用 scRNA-seq 來確定 AP 程序的小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)是否依賴于 T 細(xì)胞浸潤。我們將 EO771 細(xì)胞移植到 C57BL/6 和 RAG1-KO 小鼠中，并在第 4 天和第 10 天這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)估分選的免疫細(xì)胞中的基因表達(dá)（圖 7a）。聚類和標(biāo)記基因分析確定了九種主要免疫細(xì)胞類型（圖 7b）。亞群分析顯示，從第 4 天到第 10 天，T 細(xì)胞的頻率增加了 2 倍以上，表明隨著腫瘤進(jìn)展，T 細(xì)胞浸潤增加。 RAG1-KO 小鼠中未檢測到 T 細(xì)胞。我們還發(fā)現(xiàn) T 細(xì)胞多樣性從第 4 天到第 10 天劇烈擴(kuò)展。最值得注意的是naive T 細(xì)胞的減少以及增殖和 CD8 效應(yīng) T 細(xì)胞的增加，表明大腦中激活 T 細(xì)胞的相對頻率隨著時(shí)間的推移而增加。

       我們對小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了亞群分析，以確定它們的基因表達(dá)如何隨著時(shí)間的推移與 T 細(xì)胞激活并行變化（圖 7b）。小膠質(zhì)細(xì)胞的亞聚類顯示出與我們之前確定的相似的群體（圖7b）。我們對數(shù)據(jù)集中每個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞的與每個(gè)主題相關(guān)的 top 基因的表達(dá)、IFN 反應(yīng)、分泌和 AP 進(jìn)行評(píng)分（圖 7c）。這表明，在 C57BL/6 動(dòng)物中，從第 4 天到第 10 天，所有三個(gè)程序都隨著時(shí)間的推移而增加。在第4天，我們觀察到分泌程序的平均得分最高，AP程序的平均得分最低，這表明在早期時(shí)間點(diǎn)，比AP程序更多的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)分泌（圖7c）。我們發(fā)現(xiàn)缺乏 T 細(xì)胞的 RAG1-KO 小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞中 AP 程序僅限于不表達(dá)（圖 7c-f）。相反，我們發(fā)現(xiàn) C57BL/6 和 RAG1-KO 小鼠中分泌和 IFN 反應(yīng)程序的表達(dá)相似，表明 AP 而不是分泌和 IFN 反應(yīng)程序依賴于淋巴細(xì)胞。每個(gè)程序的 top 標(biāo)志物顯示出相似的模式，其中大量小膠質(zhì)細(xì)胞在第4天表達(dá)CD63（分泌）和BST2（IFN反應(yīng)），但有限的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD74（AP）（圖7d-f）。偽時(shí)間分析（Monocle）表明，小膠質(zhì)細(xì)胞遵循從穩(wěn)態(tài)到分泌和干擾素反應(yīng)的過程，最終以 AP 和循環(huán)簇結(jié)束（圖 7g）。這些數(shù)據(jù)支持這樣一種模型：小膠質(zhì)細(xì)胞最初上調(diào)分泌和干擾素反應(yīng)程序以響應(yīng)大腦中癌細(xì)胞的出現(xiàn)，隨后在淋巴細(xì)胞浸潤后上調(diào) AP 基因。這可能有助于維持大腦局部 T 細(xì)胞的激活，并解釋為什么小膠質(zhì)細(xì)胞損失會(huì)導(dǎo)致 T 細(xì)胞反應(yīng)減弱。值得注意的是，我們還觀察到免疫抑制細(xì)胞（Treg 和單核細(xì)胞）在稍后時(shí)間點(diǎn)的擴(kuò)增，這可能會(huì)抵消抗腫瘤免疫并解釋為什么腫瘤在某些動(dòng)物中繼續(xù)生長。

圖7|缺乏 T 細(xì)胞的動(dòng)物中小膠質(zhì)細(xì)胞活化的改變

8、促炎癥反應(yīng)在人類小膠質(zhì)細(xì)胞中是保守的

       我們研究了人類小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎癥反應(yīng)及其與 BCBM 患者的相關(guān)性。我們基于先前的工作開發(fā)了 BCBM 人源化小鼠模型，其中 MITRG 小鼠（人 CSF1、IL3 和 TPO 敲入 Rag2?/?Il2rγ?/? 小鼠）在移植人誘導(dǎo)多能性后用人小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞重建-衍生的造血祖細(xì)胞（iHPSC）進(jìn)入出生后大腦。與 BCBM 患者樣本相比，我們能夠使用這些動(dòng)物來研究人類小膠質(zhì)細(xì)胞對腫瘤發(fā)生的初始反應(yīng)。我們給 MITRG 小鼠幼崽注射了 GFP 標(biāo)記的 iHPSC，使其植入 10 周，并在心內(nèi)注射了 mCherry 標(biāo)記的 231BR 細(xì)胞（圖 8a）。 3周后收集對照小鼠和轉(zhuǎn)移小鼠，熒光顯微鏡證實(shí)了 GFP+ 人小膠質(zhì)細(xì)胞和 mCherry+ 231BR 轉(zhuǎn)移瘤的植入。隨后分離并捕獲人類細(xì)胞進(jìn)行測序（圖8a）。

       聚類和標(biāo)記基因分析揭示了一個(gè)獨(dú)特的 231BR 細(xì)胞群 (VIM) 和幾個(gè)髓系細(xì)胞群（圖 8b）。這些包括人血管周圍巨噬細(xì)胞（CD163）、小膠質(zhì)細(xì)胞（TMEM119、P2RY12）和增殖性髓系細(xì)胞群（MKI67）（圖8b）。我們鑒定出 4,904 個(gè)基因在對照大腦和轉(zhuǎn)移大腦的小膠質(zhì)細(xì)胞之間存在差異表達(dá)。 GO分析顯示，與在小鼠中觀察到的類似途徑在人類小膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)（圖8c）。我們使用基因評(píng)分來研究人類小膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性和小鼠 BCBM 中上調(diào)的核心主題的表達(dá)（圖 2d-f）。這表明，人類小膠質(zhì)細(xì)胞亞群中的 IFN 反應(yīng)、AP 和分泌程序有明顯但重疊的表達(dá)，就像在小鼠中觀察到的那樣。重要的是，該模型中 IFN 反應(yīng)和 AP 主題的上調(diào)并不像在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到的那樣強(qiáng)勁。這與 MITRG 小鼠中更嚴(yán)重的免疫缺陷以及我們的發(fā)現(xiàn)一致，即 T 細(xì)胞對于小膠質(zhì)細(xì)胞激活很重要。

       我們使用人類 BCBM 腫瘤的批量 RNA-seq 數(shù)據(jù)集比較了 BCBM 患者小膠質(zhì)細(xì)胞特征的預(yù)后相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，典型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物高表達(dá)的患者的總體生存率顯著提高，這表明小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤增加與更好的預(yù)后相關(guān)（圖8d）。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AP (MHC-II) 和分泌程序 (CSF1) 關(guān)鍵基因特征的較高表達(dá)與總生存期增加相關(guān)，而 IFN 反應(yīng)基因 BST2 的較高表達(dá)與生存期下降相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，小膠質(zhì)細(xì)胞促炎癥反應(yīng)對患者具有臨床益處，并支持以下假設(shè)：T 細(xì)胞激活小膠質(zhì)細(xì)胞（即上調(diào) AP 程序）是抗腫瘤小膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵特征，并且不完全激活（即僅 IFN 應(yīng)答計(jì)劃）會(huì)導(dǎo)致更糟糕的結(jié)果。總之，我們的研究支持一個(gè)模型，其中小膠質(zhì)細(xì)胞對于支持 CNS 中的抗腫瘤免疫反應(yīng)和抑制 BCBM 至關(guān)重要（圖 8e）。

圖8|促炎癥反應(yīng)在人類小膠質(zhì)細(xì)胞中是保守的，并且與 BCBM 患者更好的預(yù)后相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)方法

BCBM、IF 分析、CODEX 成像、scRNA-seq、流式細(xì)胞術(shù)分析、iHPCs、MULTI-seq、FTY720 HCl 給藥、細(xì)胞因子篩選、聚類和差異表達(dá)、GO術(shù)語分析和基因評(píng)分、LDA topic模型、擬時(shí)序分析、生存分析。

參考文獻(xiàn)

Evans, K.T., Blake, K., Longworth, A. et al. Microglia promote anti-tumour immunity and suppress breast cancer brain metastasis. Nat Cell Biol (2023).