SUCLG2通過琥珀?；{(diào)控肺腺癌線粒體功能障礙
線粒體功能障礙和能量代謝異常是癌癥的主要特征。然而，癌癥進(jìn)展過程中線粒體功能障礙的機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。本文證明，琥珀酰輔酶A（CoA）合成酶GDP形成亞基β（SUCLG2）的表達(dá)水平會(huì)影響肺腺癌（LUAD）細(xì)胞的整體琥珀?；ｇ牾；M分析表明，缺失SUCLG2可上調(diào)線粒體蛋白的琥珀?；?，并通過降低酶活性或蛋白穩(wěn)定性來(lái)抑制關(guān)鍵代謝酶的功能，從而抑制LUAD細(xì)胞的線粒體功能。有趣的是，SUCLG2本身也會(huì)在Lys93上發(fā)生琥珀?；@種琥珀?；瘯?huì)增強(qiáng)其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致SUCLG2的上調(diào)，促進(jìn)LUAD細(xì)胞的增殖和腫瘤發(fā)生。Sirtuin 5（SIRT5）對(duì)SUCLG2的Lys93進(jìn)行脫琥珀酰化，然后由含三方基序蛋白21（TRIM21）通過K63連接介導(dǎo)泛素化，并在溶酶體中降解。研究結(jié)果揭示了SUCLG2在線粒體功能障礙中的新作用，闡明了SUCLG2在LUAD中琥珀酰化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)平衡機(jī)制，從而為開發(fā)針對(duì)SUCLG2的抗癌藥物提供了理論依據(jù)。本文于2023年10月發(fā)表于《Advanced Science》，IF=15.1。
技術(shù)路線
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. SUCLG2是LUAD細(xì)胞增殖的必要條件，與LUAD患者的不良生存率密切相關(guān)
GDP特異性琥珀酰-CoA合成酶（SUCLG2）和ATP特異性琥珀酰-CoA合成酶（SUCLA2）是琥珀酰-CoA合成酶的兩個(gè)不同的β亞基。為了研究SUCL在LUAD 中的作用，作者首先檢測(cè)了SUCLG2和SUCLA2在LUAD細(xì)胞和組織中的蛋白表達(dá),作者發(fā)現(xiàn)，與人類支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B相比，SUCLG2在所有LUAD細(xì)胞中的蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)。與BEAS-2B相比，SUCLA2在一些LUAD細(xì)胞中上調(diào)，但在另一些細(xì)胞中則下調(diào)，而且未發(fā)現(xiàn)一致的趨勢(shì)（圖1A）。當(dāng)作者檢測(cè)LUAD組織中SUCLG2和SUCLA2的表達(dá)時(shí)，也得到了類似的結(jié)果。圖1B顯示，SUCLG2在LUAD組織中的表達(dá)高于鄰近的正常組織，而SUCLA2在大多數(shù)組織對(duì)中無(wú)明顯變化。為了研究SUCLG2和SUCLA2在LUAD細(xì)胞增殖中的功能，作者使用CRISPR-Cas9技術(shù)刪除了A549和H1299細(xì)胞中的SUCLG2或SUCLA2。然后，作者進(jìn)行了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，當(dāng)SUCLG2而非SUCLA2被敲除時(shí)，LUAD細(xì)胞的增殖率明顯下降（圖1C,D）。因此，這些結(jié)果表明，SUCLG2 而不是SUCLA2在LUAD中起著重要作用。
作者還進(jìn)行了異種移植試驗(yàn)，以確定A549野生型（WT）和SUCLG2基因敲除（SUCLG2-KO）細(xì)胞的腫瘤發(fā)生情況。與A549-WT細(xì)胞相比，A549 SUCLG2-KO的腫瘤重量和體積均有所下降（圖1E-G）。為了證實(shí)這些結(jié)果，作者使用抗Ki67、抗TTF1和抗SUCLG2抗體對(duì)A549-WT和A549-SUCLG2-KO的腫瘤樣本進(jìn)行了免疫組化（IHC）分析。Ki67在病理評(píng)估中被廣泛用作增殖標(biāo)志物，而TTF1在高級(jí)別LUAD中經(jīng)常被抑制。作者的結(jié)果顯示，A549-WT組的Ki67和SUCLG2染色明顯高于A549-SUCLG2-KO組。然而，A549-WT組的TTF1染色低于A549-SUCLG2-KO組（圖1H）。為了進(jìn)一步確定SUCLG2在LUAD中的高表達(dá)是否具有臨床意義，作者使用抗SUCLG2抗體通過IHC檢測(cè)了SUCLG2在LUAD組織陣列中的蛋白表達(dá)。該組織陣列包括來(lái)自90名LUAD患者的肺癌組織和鄰近的正常組織。結(jié)果表明，與鄰近的正常組織相比，腫瘤組織表達(dá)的SUCLG2水平明顯更高（圖1I）；染色定量進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果（圖1J）。對(duì)癌癥組織染色定量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)SUCLG2水平將樣本分為兩組?；颊呱媛逝c SUCLG2 水平相關(guān)。如圖1K所示，SUCLG2水平低的患者比SUCLG2水平高的患者生存率更高（P = 0.0252）。這些結(jié)果表明，SUCLG2影響LUAD細(xì)胞的增殖和腫瘤發(fā)生，并與LUAD的進(jìn)展和患者生存密切相關(guān)。
2. SUCLG2 缺乏導(dǎo)致線粒體功能障礙
線粒體是新陳代謝活動(dòng)的核心細(xì)胞器，而SUCLG2是TCA循環(huán)中的一個(gè)關(guān)鍵酶。因此，作者推測(cè)SUCLG2可能會(huì)通過調(diào)節(jié)線粒體代謝來(lái)影響腫瘤的增殖。作者對(duì)A549-WT和A549-SUCLG2-KO細(xì)胞進(jìn)行了非靶向代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)與A549-WT細(xì)胞相比，A549-SUCLG2-KO細(xì)胞中有15種代謝物上調(diào)，64種代謝物下調(diào)（圖2A）。作者利用KEGG通路分析對(duì)代謝物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)線粒體相關(guān)代謝通路如TCA循環(huán)和谷胱甘肽代謝發(fā)生了顯著變化（圖2B）。為了檢測(cè)SUCLG2對(duì)線粒體功能的影響，作者進(jìn)行了透射電子顯微鏡（TEM）檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞中的線粒體呈管狀，嵴清晰，而A549-SUCLG2-KO細(xì)胞中的線粒體腫脹，嵴斷裂（圖2C）。作者發(fā)現(xiàn)在A549和H1299細(xì)胞中敲除SUCLG2會(huì)降低mtDNA水平（圖2D）。此外，與對(duì)照細(xì)胞相比，SUCLG2-KO 細(xì)胞中的細(xì)胞ROS水平升高（圖2E）。敲除SUCLG2后，A549和H1299細(xì)胞中的ATP含量下降（圖2F）。隨后，作者測(cè)量了敲除SUCLG2 的A549和H1299細(xì)胞的線粒體膜電位（MMP）。與對(duì)照細(xì)胞相比，SUCLG2基因敲除細(xì)胞的線粒體膜電位明顯降低（圖2G）。從這些結(jié)果中，作者得出結(jié)論，LUAD細(xì)胞線粒體功能的維持依賴于SUCLG2的表達(dá)。
3. SUCLG2基因敲除誘導(dǎo)蛋白質(zhì)琥珀?；娜嬖黾?/strong>
SUCLG2是琥珀酰-CoA的主要水解酶，而琥珀酰-CoA是蛋白質(zhì)琥珀?；闹饕牾Ｐ揎椀孜?。琥珀酰化被認(rèn)為是一種受琥珀酰-CoA供體濃度調(diào)節(jié)的非酶促反應(yīng)。因此，作者推測(cè)SUCLG2可能通過琥珀?；{(diào)節(jié)線粒體功能和代謝重編程。由于琥珀酰-CoA會(huì)被氧化水解，因此很難檢測(cè)到。因此，作者在敲除SUCLG2的A549和 H1299細(xì)胞中檢測(cè)了由SUCLG2催化的琥珀酰-CoA產(chǎn)物琥珀酸的含量。圖3A顯示，SUCLG2基因敲除明顯降低了琥珀酸的含量。接下來(lái)作者研究了SUCLG2對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)琥珀?；降挠绊?。結(jié)果顯示，SUCLG2基因敲除增加了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的琥珀?；剑▓D3B）。然后，作者進(jìn)行了琥珀酰4D質(zhì)譜分析，以進(jìn)一步研究受SUCLG2調(diào)控的蛋白質(zhì)的琥珀酰化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SUCLG2基因敲除的細(xì)胞中，285個(gè)蛋白質(zhì)中有686個(gè)琥珀酰賴氨酸（K-su）位點(diǎn)，44個(gè)蛋白質(zhì)中有61個(gè)不同表達(dá)的琥珀酰化位點(diǎn)。作者發(fā)現(xiàn)，與A549-WT細(xì)胞相比，在A549-SUCLG2-KO細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的大部分琥珀?；险{(diào)，61%分布在線粒體中（圖3C）。GO分析表明，線粒體相關(guān)的代謝途徑，如能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化，發(fā)生了顯著變化（圖3D）。與線粒體功能相關(guān)的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、NAD依賴性蘋果酸酶（ME2）、異檸檬酸脫氫酶（IDH2）、蘋果酸脫氫酶（MDH2）和酰輔酶 A 硫代酯酶9（ACOT9）等關(guān)鍵酶的琥珀?；谔囟ㄎ稽c(diǎn)顯著上調(diào)（圖3E-J）。這些結(jié)果表明，SUCLG2基因敲除促進(jìn)了與線粒體功能相關(guān)的蛋白質(zhì)的琥珀酰化。
4. SUCLG2通過調(diào)節(jié)琥珀酰化影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或酶活性
接下來(lái)，作者研究了SUCLG2對(duì)GAPDH、ME2、IDH2、MDH2和ACOT9等關(guān)鍵酶功能的影響。作者首先檢測(cè)了SUCLG2對(duì)這些蛋白質(zhì)琥珀?；挠绊懀则?yàn)證琥珀酰4D質(zhì)譜分析結(jié)果。結(jié)果顯示，SUCLG2敲除會(huì)增加GAPDH、ME2、IDH2、MDH2和ACOT9的琥珀?；▓D4A-E），而在A549細(xì)胞中過表達(dá)SUCLG2會(huì)降低這些蛋白的琥珀?；▓D4F-J）。這些結(jié)果證實(shí)，SUCLG2調(diào)控線粒體相關(guān)蛋白的琥珀?；?。接下來(lái)，作者研究了SUCLG2如何影響這些代謝酶的功能。首先，作者用Western印跡法檢測(cè)了SUCLG2敲除的A549和H1299細(xì)胞中GAPDH、ME2、IDH2、MDH2和ACOT9的表達(dá)。圖4K顯示，SUCLG2基因敲除降低了ME2和ACOT9的蛋白表達(dá)，而GAPDH、IDH2和MDH2的表達(dá)未受影響。為了確定SUCLG2如何調(diào)控ME2和ACOT9的表達(dá)，作者測(cè)定了A549-WT和A549-SUCLG2-KO細(xì)胞中ME2和ACOT9的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，與A549-WT細(xì)胞相比，ME2和ACOT9蛋白在A549-SUCLG2-KO細(xì)胞中的降解速度更快（圖4L）。為了進(jìn)一步證實(shí)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性受琥珀?；恼{(diào)控，作者對(duì)ACOT9（K157R，K294R）和ME2（K26R，K94R）的琥珀?；稽c(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)突變，這些突變位點(diǎn)是通過琥珀酰4D質(zhì)譜分析結(jié)果確定的。由于GAPDH、IDH2和MDH2的表達(dá)不受SUCLG2敲除的影響，作者接下來(lái)檢測(cè)了這些酶的酶活性。敲除SUCLG2會(huì)降低A549和H1299細(xì)胞中GAPDH、ME2、IDH2 和MDH2的活性（圖4M-P）。這些結(jié)果表明，敲除SUCLG2會(huì)降低酶活性或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，從而抑制與線粒體功能相關(guān)的關(guān)鍵代謝酶的功能。
5. TRIM21通過K63-連接泛素化介導(dǎo)的溶酶體途徑誘導(dǎo)SUCLG2降解
作者進(jìn)行了環(huán)己亞胺（CHX）酶切實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)SUCLG2蛋白在LUAD細(xì)胞系（A549、HCC827和H1299）和BEAS-2B細(xì)胞中的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，與A549、HCC827和H1299細(xì)胞相比，SUCLG2蛋白在BEAS-2B細(xì)胞中的降解速度明顯加快（圖5A）。這些結(jié)果表明，SUCLG2在LUAD中的高表達(dá)是由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增強(qiáng)。因此，作者研究了SUCLG2的降解途徑。作者發(fā)現(xiàn)，用CHX處理A549細(xì)胞24小時(shí)后，SUCLG2的蛋白水平明顯下降，加入溶酶體抑制劑氯喹（CQ）后可以恢復(fù)，但蛋白酶體抑制劑MG132不能恢復(fù)（圖5B）。此外，作者通過加入MG132或CQ檢測(cè)了SUCLG2的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)加入CQ而不是MG132 時(shí)，SUCLG2的泛素化顯著增加（圖5C）。然后作者檢測(cè)了泛素化類型，發(fā)現(xiàn)在用CQ處理的A549細(xì)胞中，SUCLG2的K63-連接泛素化上調(diào)（圖5D）。這些結(jié)果表明，SUCLG2蛋白是通過K63鏈接泛素化介導(dǎo)的溶酶體途徑降解的。
為了確定SUCLG2的E3連接酶，作者進(jìn)行了質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)TRIM21是一種推定的SUCLG2相互作用蛋白（圖5E）。作者利用免疫沉淀技術(shù)驗(yàn)證了 SUCLG2 與 TRIM21在A549細(xì)胞中的相互作用（圖5F）。然后，作者檢測(cè)了過表達(dá)或敲除TRIM21時(shí)SUCLG2 的蛋白水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)TRIM21會(huì)降低A549細(xì)胞中SUCLG2蛋白的表達(dá)（圖5G）。此外，過表達(dá)TRIM21會(huì)加快CHX處理后SUCLG2的降解速度（圖5H）。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)在LUAD細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞中，TRIM21和SUCLG2的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖5I）。在LUAD組織中也觀察到了類似的趨勢(shì)。TRIM21的蛋白表達(dá)與SUCLG2、SIRT5和SUCLG2呈負(fù)相關(guān)，未見一致趨勢(shì)（圖5J）。作者進(jìn)一步探討了TRIM21介導(dǎo)的SUCLG2泛素鏈連接類型，過表達(dá)TRIM21增加了 SUCLG2的K63連接泛素化（圖5K）?？傊?，這些數(shù)據(jù)支持 TRIM21 通過 K63 連接泛素化 SUCLG2，然后通過溶酶體降解的模型。
作者接下來(lái)確定了受TRIM21調(diào)控的SUCLG2泛素化位點(diǎn)。利用 PhosphoSitePlus，作者確定了K101、K118、K132、K200和K386為SUCLG2的推定泛素化位點(diǎn)（圖 5L）。然后，作者構(gòu)建了含有指定突變（K101R、K118R、K132R、K200R和K386R）的SUCLG2質(zhì)粒。作者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TRIM21被過表達(dá)時(shí)，只有SUCLG2K200R的泛素化沒有發(fā)生變化（圖5M）。接下來(lái)，作者測(cè)量了野生型SUCLG2（SUCLG2WT）和 SUCLG2K200R 突變體的穩(wěn)定性。在用CHX處理細(xì)胞時(shí)，SUCLG2K200R 的降解速度比 SUCLG2WT 慢得多。此外，TRIM21的過表達(dá)并不能提高SUCLG2K200R的降解率（圖5N）。這些數(shù)據(jù)表明，SUCLG2的K200是TRIM21的主要泛素化位點(diǎn)。
6. SUCLG2的K93-琥珀?；绊?span>TRIM21介導(dǎo)的SUCLG2降解
SUCLG2定位于線粒體基質(zhì)，是將琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)化為琥珀酸的關(guān)鍵。因此，作者推測(cè)琥珀?；瘯?huì)影響SUCLG2的功能。首先，作者利用共轉(zhuǎn)印證明了SUCLG2蛋白可被琥珀?；▓D6A）。利用PhosphoSitePlus和質(zhì)譜分析結(jié)果，作者確定K78、K93和K338為SUCLG2的假定琥珀酰化位點(diǎn)（圖6B）。為了確定SUCLG2的主要琥珀?；稽c(diǎn)，作者構(gòu)建了含有所述突變（K78R、K93R 和 K338R）的SUCLG2質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)與SUCLG2WT相比，只有SUCLG2K93R的琥珀?；瘻p少（圖6C）。接下來(lái)作者測(cè)量了SUCLG2WT和SUCLG2K93R的穩(wěn)定性。用CHX處理細(xì)胞時(shí)，SUCLG2K93R蛋白水平的下降速度比SUCLG2WT快（圖6D）。這些結(jié)果表明，SUCLG2的K93是SUCLG2的主要琥珀酰化位點(diǎn)，其突變會(huì)降低蛋白在LUAD細(xì)胞中的穩(wěn)定性。
作者接下來(lái)探討了SUCLG2的琥珀酰化是否會(huì)調(diào)控其泛素化。作者進(jìn)行了聯(lián)合泛素化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與SUCLG2WT相比，SUCLG2K93R的泛素化作用更強(qiáng)（圖6E）。這一結(jié)果表明，SUCLG2K93R突變體影響了SUCLG2的泛素化。作者還發(fā)現(xiàn)TRIM21更傾向于結(jié)合SUCLG2K93R并增加其泛素化（圖6F和G）。此外，與SUCLG2WT相比，SUCLG2K93R結(jié)合了更多的p62（圖 6H）。這些結(jié)果證實(shí)，SUCLG2K93R通過增加 TRIM21介導(dǎo)的泛素化和溶酶體降解來(lái)促進(jìn)其降解。
7. SIRT5 是SUCLG2的脫琥珀?；覆⒂绊懫涞鞍追€(wěn)定性
脫琥珀?；饕梢蕾?span>NAD+ 的SIRT家族調(diào)控。作者試圖確定哪種SIRT參與了SUCLG2的脫琥珀酰化。迄今為止，已有報(bào)道稱SIRT5和SIRT7是線粒體中的脫琥珀?；?。作者研究了SIRT5和SIRT7是否能使SUCLG2去琥珀?；⒂绊懫涔δ?。在過表達(dá)SIRT5的細(xì)胞中，琥珀酰化的SUCLG2水平明顯低于含有空載體的細(xì)胞（圖7A）。圖7B顯示，敲除SIRT5增加了SUCLG2的琥珀酸化。接下來(lái)，作者通過共顯微鏡（co-IP）驗(yàn)證了SUCLG2和SIRT5之間的相互作用。結(jié)果顯示，SUCLG2 和SIRT5相互作用（圖 7C、D）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證它們之間的相互作用，作者進(jìn)行了免疫熒光和線粒體分離試驗(yàn)。結(jié)果顯示，SIRT5與SUCLG2在線粒體中共位（圖 7E和F），表明SIRT5與SUCLG2相互作用。
作者接下來(lái)探討了SIRT5和SUCLG2之間的關(guān)系。首先，過表達(dá)或敲除SIRT5，并檢測(cè)SUCLG2的表達(dá)。敲除SIRT5導(dǎo)致SUCLG2蛋白水平升高，而過表達(dá)SIRT5 則降低了SUCLG2的表達(dá)（圖7G、H）。利用CHX阻斷SUCLG2的蛋白合成，作者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT5會(huì)加速SUCLG2的降解（圖7I）。接著，作者發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT5 會(huì)顯著增加SUCLG2的泛素化水平（圖7J），而敲除SIRT5則會(huì)減少SUCLG2的泛素化（圖7K）。作者進(jìn)一步檢測(cè)了SIRT5誘導(dǎo)的SUCLG2泛素鏈的類型。過表達(dá) SIRT5增加了SUCLG2的K63連接泛素化（圖7L）。作者還利用共轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，在A549細(xì)胞中，過表達(dá)SIRT5可促進(jìn)SUCLG2與TRIM21和p62的結(jié)合（圖7M,N）。這些結(jié)果表明，SIRT5通過K63連接泛素化SUCLG2，然后通過溶酶體途徑降解。
接下來(lái)，作者探討了SIRT5與SUCLG2K93R 之間的關(guān)系。作者發(fā)現(xiàn)SIRT5并不影響SUCLG2K93R的琥珀酰化（圖7O）。綜上所述，這些結(jié)果表明SIRT5是SUCLG2 在Lys93上的脫琥珀酰化酶，促進(jìn)了TRIM21介導(dǎo)的SUCLG2降解。
8. 抑制SUCLG2在K93上的琥珀?；瘯?huì)導(dǎo)致LUAD細(xì)胞線粒體功能障礙并減少腫瘤發(fā)生
為了進(jìn)一步研究TRIM21是否通過調(diào)控SUCLG2的泛素化和降解來(lái)影響腫瘤的發(fā)生，作者在A549和H1299細(xì)胞中過表達(dá)了TRIM21和SUCLG2，細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)TRIM21抑制了A549和H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而，SUCLG2的表達(dá)克服了過表達(dá)TRIM21對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用（圖8A,B）。同樣，SIRT5也會(huì)抑制A549和H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)，而SUCLG2會(huì)降低過表達(dá)SIRT5對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用（圖8C和D）。這些結(jié)果表明，SUCLG2介導(dǎo)了SIRT5和TRIM21對(duì)LUAD細(xì)胞增殖的功能。為了給開發(fā)靶向SUCLG2的抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)，作者去除了內(nèi)源性SUCLG2，并將野生型SUCLG2（SUCLG2WT）或SUCLG2K93R突變體穩(wěn)定地重新導(dǎo)入A549細(xì)胞（圖8E）。作者評(píng)估了SUCLG2K93R 突變體對(duì)線粒體功能的影響，并使用 TEM觀察線粒體的形態(tài)變化。A549-SUCLG2WT細(xì)胞中的線粒體嵴完整，形態(tài)特征正常。然而，A549-SUCLG2K93R細(xì)胞中的線粒體出現(xiàn)空泡化和腫脹，嵴斷裂（圖8F）。為了進(jìn)一步確定線粒體質(zhì)量的差異，作者檢測(cè)了A549-SUCLG2WT和A549-SUCLG2K93R細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)。作者發(fā)現(xiàn)，與A549-SUCLG2WT細(xì)胞相比，A549-SUCLG2K93R細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)減少了（圖8G）。作者還發(fā)現(xiàn)，與 A549-SUCLG2WT 細(xì)胞相比，ROS 在 A549-SUCLG2K93R 細(xì)胞中明顯積累（圖 8H）。A549-SUCLG2WT細(xì)胞中的ATP含量高于A549-SUCLG2K93R細(xì)胞（圖8I）。作者的研究結(jié)果表明，A549-SUCLG2WT 的線粒體功能優(yōu)于 A549-SUCLG2K93R。接下來(lái)，作者在 A549-SUCLG2WT 和 A549-SUCLG2K93R 細(xì)胞中進(jìn)行了細(xì)胞增殖試驗(yàn)。結(jié)果顯示，SUCLG2K93R 突變體抑制了細(xì)胞增殖（圖 8J）。然后，作者在異種移植模型中評(píng)估了 A549-SUCLG2K93R 細(xì)胞的腫瘤發(fā)生情況。與A549-SUCLG2WT相比，A549-SUCLG2細(xì)胞的異種移植物顯示腫瘤重量和體積減少（圖8K-M），IHC結(jié)果顯示，與SUCLG2WT腫瘤相比，SUCLG2K93R突變體腫瘤的Ki67表達(dá)減少，TTF1表達(dá)增加（圖8N）。這些結(jié)果表明，抑制SUCLG2在K93上的琥珀?；瘯?huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，減少LUAD細(xì)胞的腫瘤發(fā)生。
結(jié)論：
綜上所述，作者的研究闡明了SUCLG2在線粒體功能障礙中的作用，闡明了SUCLG2在LUAD中琥珀?；閷?dǎo)的蛋白平衡機(jī)制，從而為開發(fā)靶向SUCLG2的抗腫瘤藥物提供了理論依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)方法：
RT-qPCR檢測(cè)、免疫印跡和蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光檢測(cè)、免疫組化、mtDNA提取和分析、ATP生產(chǎn)測(cè)量、線粒體和胞質(zhì)溶膠提取、MDH2活性的測(cè)量、IDH2活性的測(cè)量、ME2活性的測(cè)量、GAPDH活性的測(cè)量、琥珀酰基4D質(zhì)譜分析、非靶向代謝組學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、細(xì)胞增殖檢測(cè)、transwell遷移檢測(cè)和劃痕傷口愈合檢測(cè)、CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因破壞、細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)、體內(nèi)異種移植檢測(cè)
參考文獻(xiàn)：
Hu, Q., Xu, J., Wang, L., Yuan, Y., Luo, R., Gan, M., Wang, K., Zhao, T., Wang, Y., Han, T., Wang, J.-B., SUCLG2 Regulates Mitochondrial Dysfunction through Succinylation in Lung Adenocarcinoma. Adv. Sci. 2023, 2303535.