m6A修飾的BACE1-AS通過TUFT1依賴的Wnt信號通路激活促進結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移和干性

        結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。40%的結(jié)直腸癌患者發(fā)生頻繁轉(zhuǎn)移。肝臟是結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移最常見的遠處靶器官之一。新輔助治療和其他治療結(jié)直腸癌的新療法是在近幾十年發(fā)展起來的。然而，仍有一定比例的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，迫切需要研究驅(qū)動結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的新因素和潛在分子機制。非編碼RNA在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，進一步研究CRC轉(zhuǎn)移特異性非編碼RNA及其分子調(diào)控機制有望為CRC肝轉(zhuǎn)移提供新的生物標志物和治療靶點。β-分泌酶1反義RNA（BACE1-AS）是由β-分泌酶1反義鏈（BACE1）轉(zhuǎn)錄而來的長鏈非編碼RNA。近年來越來越多證據(jù)表明BACE1-AS參與調(diào)控腫瘤的生物學過程。BACE1-AS也是腫瘤發(fā)生的免疫相關(guān)影響因素。然而BACE1-AS在CRC中的作用尚不清楚。Tuftelin 1（TUFT1）被認為是牙齒組織發(fā)育和礦化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也被認為是多能性相關(guān)基因。雖然有少數(shù)研究報道TUFT1通過PI3K/AKT通路和AKT/GSK-3β/p65軸促進CRC進展，但TUFT1在CRC中上調(diào)的機制以及TUFT1在CRC中的作用尚未發(fā)現(xiàn)。該研究發(fā)表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.3。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 轉(zhuǎn)移性CRC中升高的BACE1-AS可通過m6A修飾穩(wěn)定

        為了揭示與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的失調(diào)的lncRNA譜，研究者從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）獲得了微陣列數(shù)據(jù)集GSE109910，并確定了轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織樣本和非轉(zhuǎn)移性樣本之間的116個差異表達的lncRNA（圖1A，B）。它對所有del中與較差總生存率相關(guān)的上調(diào)最明顯的lncrna進行了排序（圖1C）。與TCGA數(shù)據(jù)庫中的正常組織相比，CRC中上調(diào)的BACE1-AS表達證實了這一觀察結(jié)果（圖1D）。在收集的肝轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移CRC樣本（圖1E-G），以及高轉(zhuǎn)移CRC細胞株（SW620，LoVo）和低轉(zhuǎn)移CRC細胞株（SW480，HCT116）或CCD841 CoN人正常結(jié)腸上皮細胞（圖1H）中進一步驗證了它。BACE1-AS在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中起重要作用。

        N6-甲基腺苷（m6A）修飾被認為是調(diào)節(jié)RNA穩(wěn)定性的保守內(nèi)轉(zhuǎn)錄修飾。通過序列突變，研究者在BACE1-AS的155nt和790nt發(fā)現(xiàn)了兩個可能的m6A基序（圖1I），這表明m6A修飾可能促進BACE1-AS的穩(wěn)定性，從而增加轉(zhuǎn)移性CRC細胞中BACE1-AS的水平。為了驗證這一假設(shè)，使用m6A抗體的RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試驗（RIP）表明，BACE1-AS比IgG對照的富集約11.2倍（圖1J），表明BACE1-AS的m6A修飾。此外，肝轉(zhuǎn)移性CRC的m6A修飾水平顯著高于非轉(zhuǎn)移性CRC，這表明在肝轉(zhuǎn)移性CRC中，提高BACE1-AS水平需要m6A修飾（圖1K-L）。為了了解這兩個可能的m6A基序是否都被修飾，研究者通過“A”到“T”的突變產(chǎn)生了單位點或雙位點突變BACE1-AS(圖1H)。用Actinomycin D轉(zhuǎn)染野生型或突變型BACE1-AS表達載體的SW620細胞不同時間后，提取總RNA。如圖1L所示，BACE1-AS在單突變組中衰減比野生型組快，而雙突變導致比單突變BACE1-AS組衰減更快（圖1M），這表明在CRC細胞中維持BACE1-AS穩(wěn)定性都需要兩個m6A基序。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中，155nt和790nt的m6A修飾導致BACE1-AS表達上調(diào)。

圖1 m6A修飾促進轉(zhuǎn)移性CRC中BACE1-AS升高

2. IGF2BP2是m6A介導的BACE1-AS穩(wěn)定所必需的

        通過分析ENCORI數(shù)據(jù)庫，研究者發(fā)現(xiàn)IGF2BP2（m6A讀取器和RNA穩(wěn)定劑）是一種潛在的BACE1-AS結(jié)合蛋白（圖2A）。IGF2BP2在轉(zhuǎn)移性CRC中增加（圖2B，C），并與BACE1-AS表達呈正相關(guān)（圖2D，E）。此外，較高的IGF2BP2水平與較差的預后相關(guān)（圖2F）。IGF2BP2抗體RIP檢測顯示，與IgG對照相比，BACE1-AS極度富集（圖2G）。為了研究BACE1-AS和IGF2BP2之間的相互作用，研究者用S1M標記BACE1-AS，S1M是鏈親和素結(jié)合適配體S1衍生的生物素樣適配體。然后，將S1M標記的BACE1-AS轉(zhuǎn)染SW620細胞，并使用鏈霉親和素珠對細胞提取物進行下拉實驗。IGF2BP2抗體免疫印跡檢測到特異性陽性條帶（圖2H），代表IGF2BP2/BACE1-AS的天然相互作用。然而，BACE1-AS中的m6A單突變體減弱了這一陽性條帶強度，而雙突變體導致了陰性結(jié)局（圖2H）。這些觀察表明IGF2BP2可以通過兩個m6A位點與BACE1-AS結(jié)合。接下來，研究者研究了IGF2BP2是否保護BACE1-AS免受RNA降解。IGF2BP2的缺失加速了BACE1-AS的衰減（圖2I），而IGF2BP2的過表達抑制了BACE1-AS的衰減（圖2J）。此外，m6A基序突變消除了IGF2BP2對BACE1-AS的保護作用（圖2K）。這些數(shù)據(jù)進一步支持IGF2BP2是m6A介導的BACE1-AS穩(wěn)定所必需的。

圖2 IGF2BP2結(jié)合并促進轉(zhuǎn)移性CRC中BACE1-AS的穩(wěn)定性

3. BACE1-AS促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移

        為了研究BACE1-AS在CRC肝轉(zhuǎn)移中的生物學作用，研究者對攜帶BACE1-AS的慢病毒或空病毒感染的HCT116細胞進行了轉(zhuǎn)移測定。傷口愈合實驗顯示BACE1-AS過表達后的更快愈合速度（圖3A）。此外，Transwell實驗顯示過表達BACE1-AS的細胞具有更高的遷移和侵襲能力（圖3B）。相反，在SW620細胞中，通過攜帶靶向BACE1-AS的shRNA的慢病毒感染敲低BACE1-AS抑制了細胞的遷移和侵襲（圖3C，D）。

      研究者構(gòu)建了BACE1-AS敲除的SW620細胞，以更好地表征BACE1-AS在CRC轉(zhuǎn)移中的作用。BACE1-AS敲除導致細胞侵襲和遷移顯著減少（圖3E）。值得注意的是，這些下降的轉(zhuǎn)移表型可以通過外源性表達野生型BACE1-AS恢復（圖3E）。然而，m6A基序突變的BACE1-AS不能恢復BACE1-AS敲除細胞的轉(zhuǎn)移能力（圖3E），表明m6A修飾對BACE1-AS促進CRC肝轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。有趣的是，在BACE1-AS敲除細胞中，IGF2BP2的缺失消除了BACE1-AS過表達促進的轉(zhuǎn)移增強（圖3F）。

      接下來，研究者將BACE1-AS敲除的SW620細胞和親本SW620細胞注射到NOD SCID小鼠的脾臟中，研究BACE1-AS在體內(nèi)促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用。飼養(yǎng)6周后處死小鼠，計數(shù)肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量。正如預期的那樣，注射親代SW620的NOD SCID小鼠在肝臟中產(chǎn)生了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（圖3G）。然而，BACE1-AS的缺失顯著抑制了SW620細胞的轉(zhuǎn)移，其特征是肝臟中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量減少（圖3G）。這些數(shù)據(jù)表明BACE1-AS在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。

圖3 BACE1-AS促進結(jié)直腸癌體內(nèi)外轉(zhuǎn)移

4. BACE1-AS促進結(jié)直腸癌細胞的干性

        癌癥干細胞已被提出可促進CRC轉(zhuǎn)移。因此，研究者進一步研究BACE1-AS是否促進CRC細胞的干性。與對照細胞相比，通過慢病毒感染的BACE1-AS異位表達顯著增加了腫瘤球的形成，在球的數(shù)量和球的直徑（圖4A）。BACE1-AS過表達顯著增加了包括NANOG和OCT4在內(nèi)的干性相關(guān)因子的蛋白水平（圖4B）。相反，BACE1-AS敲除細胞表現(xiàn)出較弱的成球能力（圖4C）和降低的干性相關(guān)因子的蛋白水平（圖4D）。此外，在BACE1-AS敲除細胞中恢復BACE1-AS恢復了腫瘤球形成能力和NANOG，OCT4的表達（圖4E，F）。這些數(shù)據(jù)表明，BACE1-AS促進了CRC細胞的干性，這可能有助于CRC的肝轉(zhuǎn)移。

圖4 BACE1-AS促進結(jié)直腸癌細胞的干性

5. BACE1-AS通過TUFT1促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移

        作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）促進靶mRNA表達是lncRNA發(fā)揮作用的關(guān)鍵機制。LncACTdb 3.0數(shù)據(jù)庫識別出潛在的BACE1/TUFT1 ceRNA網(wǎng)絡軸。有BACE1-AS/TUFT1軸的CRC患者的總生存期比沒有這一ceRNA網(wǎng)絡的患者短（圖5A）。此外，TUFT1缺失導致的這些表型與BACE1-AS缺失一致，提示BACE1-AS可能通過促進TUFT1促進結(jié)直腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移。為了驗證這一假設(shè)，研究者檢測了BACE1-AS敲除細胞中TUFT1的表達。正如預期的那樣，與親本細胞相比，BACE1-AS敲除細胞中的TUFT1表達顯著降低（圖5B）。外源性表達TUFT1（圖5C）恢復了BACE1-AS敲除SW620細胞的遷移和侵襲能力（圖5D）。此外，通過形成的腫瘤球的數(shù)量和大小分析，TUFT1過表達還恢復了BACE1-AS敲除的SW620細胞的干性特征（圖5E）。重要的是，TUFT1過表達還恢復了BACE1-AS敲除細胞在體內(nèi)的肝轉(zhuǎn)移（圖5F）。這些數(shù)據(jù)進一步表明BACE1-AS通過TUFT1促進結(jié)直腸癌細胞的肝轉(zhuǎn)移。

圖5 BACE1-AS通過TUFT1促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

6. BACE1-AS促進TUFT1依賴的Wnt信號通路激活

        為了探索BACE1-AS調(diào)控的參與CRC肝轉(zhuǎn)移的信號通路，研究者獲得了微陣列數(shù)據(jù)集GSE224235，對比匹配的原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶，發(fā)現(xiàn)幾個調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路對CRC肝轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，其中Wnt信號通路（圖6A-B）。qRT-PCR分析證實，與非轉(zhuǎn)移性CRC樣本相比，在轉(zhuǎn)移性CRC細胞中，參與Wnt信號通路的蛋白編碼的mRNA表達上調(diào)，包括WNT3A，WNT7B，CTNNB1，MYC，SOX2和FOSL1（圖6C）。蛋白質(zhì)印跡分析表明，β-catenin，c-Myc，SOX2和FOSL1的蛋白水平反映了mRNA水平的一致變化（圖6D）。

        有研究表明Wnt信號通路對腫瘤轉(zhuǎn)移和干性維持至關(guān)重要。因此，研究者研究BACE1-AS的促轉(zhuǎn)移功能是否依賴于Wnt信號通路。BACE1-AS敲除顯著降低了GSK3β的磷酸化以及β-catenin和Wnt信號通路下游靶基因SOX2和c-Myc的蛋白水平（圖6E）。此外，BACE1-AS修復恢復了BACE1-AS敲除細胞中降低的β-catenin，SOX2和c-Myc水平（圖6E）。有趣的是，TUFT1敲低抑制了GSK3β的磷酸化，進而降低了Wnt信號下游靶點的蛋白水平（圖6F），而TUFT1過表達則表現(xiàn)出相反的作用（圖6G），表明TUFT1是Wnt信號通路的上游調(diào)節(jié)因子。值得注意的是，BACE1-AS過表達誘導的Wnt信號通路的過度激活可以被TUFT1缺失所逆轉(zhuǎn)（圖6H），表明BACE1-AS以TUFT1依賴的方式激活Wnt信號通路。

圖6 BACE1-AS促進TUFT1依賴的Wnt信號通路激活

7. 藥物抑制Wnt信號通路可抑制BACE1-AS促進的結(jié)直腸癌干性和肝轉(zhuǎn)移

        接下來，研究者研究了Wnt信號通路的激活是否對BACE1-AS促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。正如預期的那樣，在BACE1-AS敲除的SW620細胞中，通過CT99021處理（10μM）重新激活Wnt信號通路可恢復轉(zhuǎn)移潛能的喪失（圖7A）。MSAB（10μM）對Wnt信號通路的藥理抑制顯著抑制了SW620細胞的腫瘤球形成和干性相關(guān)因子NANOG和OCT4的表達（圖7B-C）。MSAB處理也抑制SW620細胞的遷移和侵襲能力（圖7D）。更重要的是，MSAB治療阻斷了BACE1-AS過表達細胞的腫瘤球形成和遷移和侵襲能力（圖7E-F）。體內(nèi)實驗表明，MSAB處理（20mg/kg）抑制BACE1-AS過表達促進體內(nèi)CRC肝轉(zhuǎn)移（圖7G）。

        綜上所述，這些結(jié)果表明Wnt信號通路的激活在BACE1-AS促進肝轉(zhuǎn)移中是至關(guān)重要的。在體外和體內(nèi)實驗中，抑制Wnt信號通路可以抑制BACE1-AS促進的結(jié)直腸癌干性和肝轉(zhuǎn)移。

圖7 藥物抑制Wnt信號通路可抑制BACE1-AS促進的結(jié)直腸癌干性和肝轉(zhuǎn)移

8. BACE1-AS通過靶向miR-214-3p增強TUFT1的表達

        由于研究者發(fā)現(xiàn)BACE1-AS通過TUFT1促進結(jié)直腸癌細胞的肝轉(zhuǎn)移，并且預測了潛在的ceRNA網(wǎng)絡，研究者接下來嘗試建立BACE1-AS和TUFT1之間的ceRNA網(wǎng)絡。ENCORI數(shù)據(jù)庫預測BACE1-AS和TUFT1中均有miR-214-3p結(jié)合位點（圖8A）。BACE1-AS敲除顯著增加了miR-214-3p的表達（圖8B）。相反，miR-214-3p模擬物抑制BACE1-AS的表達（圖8C）。RIP實驗顯示，與IgG顆粒相比，Ago2抗體免疫沉淀顯示SW620細胞的沉淀顆粒中BACE1-AS和miR-214-3p顯著富集（圖8D）。雙熒光素酶報告實驗檢測BACE1-AS與miR-214-3p的直接相互作用。與RIP實驗一致，研究者發(fā)現(xiàn)miR-214-3p mimics顯著抑制BACE1-AS-WT組的熒光素酶活性，但不改變結(jié)合位點突變組的熒光素酶活性（圖8E）。

        接下來，研究者檢測BACE1-AS是否通過miR-214-3p調(diào)控TUFT1的表達。過表達miR-214-3p抑制TUFT1的表達（圖8F）。熒光素酶報告實驗表明，miR-214-3p mimics顯著降低了TUFT1-WT的熒光素酶活性，但在結(jié)合位點突變組中并沒有改變熒光素酶活性（圖8G）。在BACE1-AS敲除細胞中，miR-214-3p抑制劑可以挽救TUFT1的表達（圖8H）。此外，過表達BACE1-AS誘導的miR-214-3p可以逆轉(zhuǎn)共轉(zhuǎn)染TUFT1上調(diào)mimics（圖8I）。同樣，熒光素酶報告實驗也顯示出類似的改變。miR-214-3p mimics消除了TUFT1-WT組中BACE1-AS過表達對熒光素酶活性的促進作用（圖8J）。這些結(jié)果表明BACE1-AS通過吸附miR-214-3p促進TUFT1的表達。

圖8 BACE1-AS通過靶向miR-214-3p增強TUFT1的表達

實驗方法：

        細胞培養(yǎng)，慢病毒感染，RNA分離和qRT-PCR，免疫印跡，原位雜交（ISH），RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）測定，傷口愈合試驗，跨孔檢測，腫瘤球形成試驗，體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移形成實驗，雙熒光素酶報告基因檢測

參考文獻：

        Wang X, Liu Y, Zhou M, Yu L, Si Z. m6A modified BACE1-AS contributes to liver metastasis and stemness-like properties in colorectal cancer through TUFT1 dependent activation of Wnt signaling. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Nov 21;42(1):306. doi: 10.1186/s13046-023-02881-0.