GPNMB+ Gal-3+ 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)免疫抑制和肝細(xì)胞癌發(fā)生

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2024-06-28
我們鑒定了 HCC 進(jìn)展過程中出現(xiàn)的三個肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞群,揭示了單細(xì)胞 HCC 進(jìn)展圖譜,并發(fā)現(xiàn) GPNMB+ Gal-3+ 實(shí)質(zhì)細(xì)胞是導(dǎo)致免疫抑制微環(huán)境的主要亞群......

 

摘要:

        肝細(xì)胞癌(HCC)的形成是一個多步驟的病理過程,涉及異質(zhì)免疫抑制腫瘤微環(huán)境的演變。然而,所涉及的特定細(xì)胞群及其起源和對 HCC 發(fā)展的貢獻(xiàn)仍然很大程度上未知。在這里,應(yīng)用全面的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序來分析毒素誘導(dǎo)的肝臟腫瘤發(fā)生和 HCC 患者的大鼠模型。具體來說,我們鑒定了 HCC 進(jìn)展過程中出現(xiàn)的三個肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞群,稱為代謝肝細(xì)胞 (HCMeta)、具有分化潛力的 Epcam+ (EP+Diff) 和免疫抑制惡性轉(zhuǎn)化子集 (MTImmu)。這些不同的亞群形成了描繪肝癌發(fā)生動態(tài)景觀的致癌軌跡,其特征基因反映了從 EP+Diff MTImmu 的轉(zhuǎn)變。重要的是,GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞表現(xiàn)出惡性和免疫抑制特性。此外,SOX18GPNMB+ Gal-3+ MTImmu細(xì)胞的生成和惡性轉(zhuǎn)化所必需的。研究發(fā)現(xiàn) GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 子集的富集與患者預(yù)后不良和較高的復(fù)發(fā)率相關(guān)??偟膩碚f,我們揭示了單細(xì)胞 HCC 進(jìn)展圖譜,并發(fā)現(xiàn) GPNMB+ Gal-3+ 實(shí)質(zhì)細(xì)胞是導(dǎo)致免疫抑制微環(huán)境的主要亞群,從而導(dǎo)致 HCC 惡性。該研究于202311月發(fā)表在《The EMBO journa》,IF11.4。

技術(shù)路線:

 

 

 

結(jié)果:

1、scRNA-seq 鑒定出肝癌發(fā)生過程中具有免疫抑制能力的 MTImmu 細(xì)胞群

        為了研究惡性轉(zhuǎn)化過程中的分子和細(xì)胞特征,并探索 HCC 發(fā)展過程中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞群的進(jìn)化路徑,我們對二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的大鼠在不同時間點(diǎn)(04、8、12、16 周)進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測序(scRNA-seq)分析 (圖 1A)。經(jīng)過質(zhì)量檢查,收集了 45,390 個來自大鼠肝組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。然后,我們使用統(tǒng)一流形近似和投影(UMAP)分析將所有細(xì)胞分類為T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、B細(xì)胞、粒細(xì)胞-單核細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)、單核細(xì)胞(Mono)、樹突狀細(xì)胞(DC) 、漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞 (pDC)、巨噬細(xì)胞 (Mφ)、中性粒細(xì)胞 (Neu)、成纖維細(xì)胞 (Fib)、基質(zhì)細(xì)胞 (SC)、膽管上皮細(xì)胞 (BEC) 和非惡性實(shí)質(zhì)細(xì)胞 (NMPC) --基于已知細(xì)胞譜系的特定標(biāo)記基因(圖 1B)。同時,通過推斷染色體拷貝數(shù)變異(CNV)來區(qū)分惡性細(xì)胞(圖1B)。

        接下來,我們收集了 NMPC 和惡性腫瘤,并通過聚類分析將它們分為 10 個亞群,以探索這兩種細(xì)胞類型之間潛在的中間狀態(tài)(圖 1C D )。簇 1-3 傾向于表達(dá)與肝細(xì)胞 (HC) 代謝相關(guān)的特征基因,例如 Pon1、Cps1 Hnf4a,而簇 4-6 高度表達(dá)分化相關(guān)標(biāo)記,包括 Epcam、Cd44、Cd24 Aldh1a1,顯示出強(qiáng)大的分化潛力(圖1EF)。基于這些觀察,我們在下文中分別將簇 1-3 4-6 表示為 HCMeta EP+Diff(圖 1G)。簇 7-9 保留了一些 EP+Diff 特征(Cd44、Cd24 Aldh1a1),但它們特異性表達(dá)多種免疫抑制標(biāo)記物,例如 Cd274、MgpGrn Lgals3,以及淋巴細(xì)胞和骨髓源性抑制細(xì)胞 (MDSC) 招募趨化因子 Ccl5 Cxcl2(圖 1F)。鑒于其 EP+Diff 和惡性細(xì)胞的混合特性,我們將 C7-9 簇稱為免疫抑制惡性轉(zhuǎn)化子集 MTImmu(圖 1E-G)。重要的是,隨著肝癌發(fā)生的發(fā)展,HCMeta群體逐漸縮小,而EP+DiffMTImmu的比例在HCC進(jìn)展過程中以時間依賴性方式增加(圖1H),這表明建立腫瘤免疫抑制的動態(tài)進(jìn)化模式微環(huán)境??偠灾?,這些結(jié)果表明在肝癌發(fā)生過程中存在一種具有潛在干性和免疫抑制能力的新型 MTImmu 群體。


 

 

2、人與大鼠 HCC 相關(guān) MTImmu 的跨物種比較分析

        HCC 患者肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的本體發(fā)生和進(jìn)化仍然是一個尚未充分探索的領(lǐng)域。為此,我們采用 scRNA-seq 來研究從四名 HCC 患者的腫瘤 (T) 和鄰近腫瘤組織 (AT) 中分離的細(xì)胞(圖 2A)。我們通過推斷 CNV 將惡性細(xì)胞與總細(xì)胞區(qū)分開來。同時,通過常用的特征標(biāo)記來識別T細(xì)胞、B細(xì)胞、Mono、DC、漿細(xì)胞(PC)、、FibSCNMPC(圖2BC)。樣本中不同細(xì)胞類型的比例顯示,與 PCA 相比,腫瘤含有更多的 NMPC、Fib ,但 SC T 細(xì)胞更少。

        接下來,我們匯集了所有 NMPC 和惡性細(xì)胞,隨后將它們分為 11 個簇(圖 2D E)。與大鼠的基因表達(dá)譜類似,人類(hC1)簇1是典型的肝細(xì)胞(HC)代謝組(稱為HCMeta),其特征為HNF4A、PON1AGXT(圖2F)。此外,hC2-4簇以分化相關(guān)基因(GSTA2、HES1、ALDH1A1CD24)為特征,因此被稱為EP+Diff(圖2FG)。在保留 EP+Diff 特征的同時,hC5-7 簇還表達(dá)參與 MDSC Treg 趨化性、T 細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)節(jié)和干細(xì)胞維持相關(guān)基因的基因,如 S100A9、CXCL17GPNMB、CCL20LGALS3 SOX4。 hC5-7簇似乎是EP+Diff和惡性細(xì)胞的混合狀態(tài),因此我們將其稱為免疫抑制惡性轉(zhuǎn)化(MT Immu)(圖2FG)。hC9-11簇顯示出參與糖酵解和糖異生、細(xì)胞增殖、EMT、血管生成和脂質(zhì)積累的惡性腫瘤相關(guān)基因(PEG10ENO3、CCNB1UBE2C)的較高表達(dá)水平(圖2FG)。

        根據(jù)大鼠和患者實(shí)質(zhì)細(xì)胞各亞群的特定基因表達(dá)模式,例如 HCMeta、EP+Diff MTImmu(圖 1D-G 2E-G),我們使用 Garnett 評估了這些細(xì)胞的跨物種保守性(https://coletrapnell-lab.github.io/garnett/),一種基于回歸的機(jī)器學(xué)習(xí)分類器,用于識別細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)模式。作為原理證明,機(jī)器能夠預(yù)測具有非常高相關(guān)性分?jǐn)?shù)的相似子集。令人驚訝的是,機(jī)器檢測到大鼠和患者 MTImmu 子集具有非常高的相似性,特別是 C8、C9(大鼠)和 hC7(患者)(圖 2H)。此外,UMAP 顯示了特定基因的相似表達(dá)模式,例如 LGALS3、GPNMBCD47 CD24,再次表明大鼠和患者之間 MTImmu 子集的保守性。

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證更多HCC患者中是否存在相似的細(xì)胞簇,我們下載了HCC患者的原始數(shù)據(jù)(GSE112271GSE151530、GSE210679GSE149614)。合并10例患者的樣本(實(shí)質(zhì)細(xì)胞超過1000個細(xì)胞)。然后,我們使用已知的細(xì)胞譜系特異性標(biāo)記基因進(jìn)行 UMAP 分析。實(shí)質(zhì)細(xì)胞分為 11 個簇。我們觀察到,來自鄰近肝組織(N)的實(shí)質(zhì)細(xì)胞與腫瘤組織緊密纏繞,顯示出與我們當(dāng)前研究中發(fā)現(xiàn)的相似的簇。肝臟代謝特征基因(HNF4A、CPS1PON1)高表達(dá)的簇5,8;簇 24 呈現(xiàn)干細(xì)胞分化潛力基因(CD24、EPCAM、CD47、LGALS3 SOX4);簇1、911過表達(dá)免疫抑制相關(guān)基因LGALS3GPNMB,與LGALS3+ GPNMB+ MTIMMU子集極其相似(圖2FG)。

 


 

 

3MTImmu展示EP+Diff的潛在轉(zhuǎn)變

        為了縱向觀察惡性細(xì)胞的起源,我們進(jìn)行了 RNA 速度分析,并揭示了可能分別源自 EP+Diff 子集到 HCMeta MTImmu 子集的多個分支的流形(圖 3A)。通過沿偽時間對細(xì)胞進(jìn)行著色,EP+Diff的分支主要位于軌跡樹的起始區(qū)域(①),最終在一個分支中演化為HCMeta(②),或者在另一個分支中直接轉(zhuǎn)化為MTImmu(③)(圖3BD)。 MTImmu 在正常組(NOR)或 DEN 治療后早期時間點(diǎn)(4 8 周)的樣本中幾乎觀察不到,但在暴露于 DEN 12 16 周的大鼠中顯著增加(圖 3C D)。

        此外,我們提取了從分支①到分支②的轉(zhuǎn)換中上調(diào)的基因。 GO分析顯示,與肝細(xì)胞功能相關(guān)的生物過程,如膽固醇代謝和穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)生物合成和運(yùn)輸,在分支②中富集。同時,分支①轉(zhuǎn)變?yōu)榉种Б鄣纳险{(diào)基因在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)、細(xì)胞分裂和干細(xì)胞維持方面顯著富集。一致地,作為肝細(xì)胞功能指標(biāo)的幾個基因,包括 PonCps1 Agxt,也在 HCMeta 中高表達(dá)(②,圖 3E)。干性相關(guān)基因 Mgp Cd44 以及 Epcam EP+Diff(①)和 MTImmu(③)中均富集;而 Lgals3、Gpnmb Kdr MTImmu 中特別升高(③,圖 3E)。

        接下來,我們檢查了 HCC 患者是否可以觀察到這些現(xiàn)象。事實(shí)上,RNA速度分析表明EP+Diff作為潛在的根轉(zhuǎn)化為HCMeta、MTImmu和惡性細(xì)胞,而MTImmu表現(xiàn)出更傾向于轉(zhuǎn)化為不同簇的惡性細(xì)胞,這可能解釋了肝癌的高度異質(zhì)性(圖3F) 。偽時間分析發(fā)現(xiàn),在從 EP+Diff MTImmu 的潛在轉(zhuǎn)變過程中,與免疫抑制(LGALS3 GPNMB)和干性(SOX4、EPCAM CD47)相關(guān)的基因逐漸升高(圖 3G),表明干性和MTImmu 的免疫抑制特性??偟膩碚f,這些結(jié)果表明MTImmu具有免疫抑制和干細(xì)胞特性,并可能在HCC腫瘤發(fā)生過程中表現(xiàn)出EP+Diff的惡性轉(zhuǎn)化。


 

 

4GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞表現(xiàn)出致瘤能力

        為了驗(yàn)證 MTImmu 群體的存在并對其進(jìn)行功能表征,我們采用了通過外源注射原代 EPCAM+ 細(xì)胞并結(jié)合 DEN 治療誘導(dǎo)的大鼠 HCC 模型。我們從 GFP 標(biāo)記的胎肝(13.5 天)中分選了原代 EPCAM+ 細(xì)胞,并將其注射到用 DEN 預(yù)處理 2-5 周的雄性大鼠中。受體大鼠接受 DEN 治療 16 周,同時使用 0.9% NaCl 作為模擬對照。我們發(fā)現(xiàn)接受 EPCAM+ 細(xì)胞的大鼠早在植入后 12 周就出現(xiàn)了腫瘤,而對照組則沒有觀察到腫瘤。此外,DEN 治療后 16 周時,受體大鼠表現(xiàn)出更高的腫瘤發(fā)生率和更大的腫瘤尺寸。此外,通過蘇木精-伊紅染色,EPCAM+細(xì)胞注射組在12周或16DEN誘導(dǎo)的大鼠中比對照組有更多更大的微觀損傷。

        為了研究將 EPCAM+ 細(xì)胞注射到肝臟中的效率及其隨后的命運(yùn),我們檢查了注射后 2 周時肝臟中重新填充的 GFP 標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量。我們通過尾靜脈注射 1 × 108 GFP 標(biāo)記的 EPCAM+ 細(xì)胞 3 次。流式細(xì)胞術(shù)顯示,獲得的1.6×1010個細(xì)胞中,有5.26%(即8.4 × 108 個細(xì)胞)源自注射的 GFP 標(biāo)記細(xì)胞,表明注射的 EPCAM+ 細(xì)胞在肝臟中駐留和擴(kuò)增。為了研究注射的 EPCAM+ 細(xì)胞的細(xì)胞命運(yùn),我們檢測了注射的 GFP 標(biāo)記細(xì)胞轉(zhuǎn)化為惡性和 MTImmu 群體的可能性。隨后,我們在 DEN 治療后 8 周和 16 周的時間點(diǎn)追蹤了受體大鼠中 GFP 標(biāo)記的 EPCAM+ 細(xì)胞。支持我們的假設(shè)的是,在 DEN 治療后 16 周時,發(fā)現(xiàn) Gal-3+ GPNMB+ (MTImmu) AFP+(惡性腫瘤)細(xì)胞分別占 GFP 陽性細(xì)胞的 28.7% 14.2%。與這些結(jié)果一致,免疫熒光染色證實(shí)了受體大鼠腫瘤中 GFP Gal-3GPNMB AFP 的共染色(圖 4A)??傊?,這些數(shù)據(jù)證實(shí)了 EPCAM+ 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為 GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞的可能性。

        為了用 MTImmu 表明 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞的身份,我們對 GPNMB+ Gal-3+ GPNMB Gal-3 細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。在 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞和 MTImmu 細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組之間發(fā)現(xiàn)了很強(qiáng)的相關(guān)性,表明它們具有重疊的身份(圖 4B)。為了表征 MTImmu 細(xì)胞的分子特征和功能,我們篩選了 1,851 個在 GPNMB+ Gal-3+ GPNMB Gal-3 細(xì)胞中上調(diào)的基因(圖 4C)。這 1,851 個基因在免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因集中顯著富集。一致地,免疫抑制配體和細(xì)胞干性相關(guān)基因在 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞中高表達(dá),而 HCMeta 特征基因在 GPNMB Gal-3 細(xì)胞中高表達(dá)(圖 4D)??傊?,這些結(jié)果表明 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞最有可能是 MTImmu 細(xì)胞。

        為了測試 MTImmu 亞群的干性,我們進(jìn)行了球體形成測定,發(fā)現(xiàn) GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞在 24 小時和 72 小時時表現(xiàn)出比 GPNMB Gal-3 組更高的自我更新能力(圖 4E F)。為了驗(yàn)證 GPNMB Gal-3 對干性的作用,我們敲低 GPNMB Gal-3 并進(jìn)行球體形成實(shí)驗(yàn),以評估 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞 1 周后的自我更新能力。 EPCAM+細(xì)胞中Gal-3GPNMB的敲低顯著降低了它們的球體形成效率(圖4GH)。免疫熒光 (IF) 染色證實(shí)了 DEN 治療后 16 周時 GFP Gal-3 GPNMB 在大鼠腫瘤中的共定位(圖 4I)。此外,我們在EPCAM+細(xì)胞注射組中觀察到肺和結(jié)腸轉(zhuǎn)移的形成,并通過HE染色進(jìn)一步證實(shí)。與 16 DEN 誘導(dǎo)大鼠的腫瘤一致,IF 染色在肺和結(jié)腸轉(zhuǎn)移中顯示出 GFP Gal3 GPNMB 共定位的強(qiáng)烈信號??傊?,這些數(shù)據(jù)表明 GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞在 HCC 原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性微環(huán)境中均具有干性特征。


 

 

5、GPNMB+ Gal-3+ MTImmu 細(xì)胞抑制 CD8+ T 細(xì)胞抗腫瘤免疫

        耗竭的 T (Tex) 和調(diào)節(jié)性 T (Treg) 細(xì)胞參與免疫抑制和腫瘤進(jìn)展的事實(shí)已得到充分證實(shí)。我們根據(jù) scRNA-seq 數(shù)據(jù)中標(biāo)記基因的差異表達(dá),將來自不同時間點(diǎn)大鼠的 T 細(xì)胞分為六個不同的亞群:自然殺傷 T (NKT)、Tex、終末分化效應(yīng)記憶 T細(xì)胞 (TEMRA)、naive T 細(xì)胞、細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞 (CTL) Treg。為了驗(yàn)證 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞的免疫抑制活性,我們通過細(xì)胞-細(xì)胞相互作用分析破譯了 HCMeta、EP+Diff、MTImmu T 細(xì)胞亞群之間的配體-受體 (L-R) 相互作用。正如預(yù)期的那樣,T 細(xì)胞(尤其是 Tex Treg)與 MTImmu 細(xì)胞的相互作用次數(shù)比與 HCMeta EP+Diff 細(xì)胞的相互作用更頻繁(圖 5B)。在MTImmuTex之間的強(qiáng)相互作用中,存在多個免疫抑制配體-受體對,例如Cd274-Pdcd1、Grn-Tnfrsf1bBag6-Ncr3Cd112-Tigit(圖5C)。同時,在MTImmuTreg之間發(fā)現(xiàn)了多對相互作用,包括Ccl5-Ccr5CD274-Pdcd1、Icam1-ItgalCrlf2-Tslpr。

        同樣,我們還從 HCC 患者的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中提取了 T 細(xì)胞,并將其分為七個亞群:NKT、Tex、記憶 T 細(xì)胞 (Mem T)、naive T、細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞 (CTL)、黏膜相關(guān)恒定T細(xì)胞(MAIT)和Treg(圖5D)。有趣的是,絕大多數(shù)T細(xì)胞被捕獲在鄰近的腫瘤組織(AT)中,而浸潤到腫瘤組織(T)的總T細(xì)胞明顯減少。此外,NKTCyto T、MAIT Mem T 細(xì)胞幾乎只存在于鄰近腫瘤組織(AT)中,而腫瘤組織(T)中的大多數(shù) T 細(xì)胞是 Tex、Na?ve T Treg(圖 5D)。 L-R相互作用分析表明T細(xì)胞與MTImmu細(xì)胞形成緊密的聯(lián)系(圖5E)。一組與免疫抑制相關(guān)的 L-R 對在 MTImmu Tex 之間表現(xiàn)出較高水平,例如 TNFSF9-TNFRSF9、LGALS9-CD44、LGALS9-HAVCR2 PRR3-TIGHT(圖 5F)。同樣,免疫抑制相關(guān)的 L-R 對,包括 SPP1-CD44、SIRPG-CD47 LGALS9-CD44,在 MTImmu Treg 之間顯著富集。這些結(jié)果表明MTImmu細(xì)胞可能通過直接與T細(xì)胞相互作用發(fā)揮免疫抑制功能。

        為了驗(yàn)證 MTImmu 細(xì)胞對 T 細(xì)胞的潛在免疫抑制作用,我們使用分選的 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞和大鼠血源性 CD45+ CD3+ T 細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),并評估 CD8+ T 細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子的情況(圖5G,左)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示,與 GPNMB+ Gal-3+ 細(xì)胞共培養(yǎng)后,血液中 CD8+ IFNc+ (21.2%) CD8+ GZMB+ (45.3%) T 細(xì)胞的比例分別急劇下降至 10.9 21.1%(圖5G H)。相反,當(dāng)與 GPNMB Gal-3 細(xì)胞共培養(yǎng)時,T 細(xì)胞的比例沒有顯著改變(18.8% 33.3%)(圖 5G H)。一致地,IF染色證實(shí)了腫瘤組織中GPNMB+ Gal-3+ MTImmuPD1+ T細(xì)胞之間的共定位(圖5I)。總之,這些結(jié)果表明 MTImmu 在肝癌發(fā)生過程中具有免疫抑制能力。


 

 

6、SOX18GPNMB+Gal-3+MTimu細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和免疫抑制能力中的作用

        為了進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)錄因子在GPNMB+Gal-3+MTImu細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的動態(tài)變化,我們在大鼠和患者中進(jìn)行了單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推理和聚類(SCENIC)分析。根據(jù)對HCMeta、EP+diffMTImuTF活性的比較,我們在大鼠和肝細(xì)胞癌患者中確定了MTImu特異性的TF網(wǎng)絡(luò),包括JunEgr1MYC,它們已被證明與免疫抑制活性有關(guān)(6A和圖B)。重要的是,這項(xiàng)分析還發(fā)現(xiàn)了三個新的調(diào)節(jié)基因HDAC2SOX18TEAD2,在大鼠和肝細(xì)胞癌患者的MTImu中顯示出更高的調(diào)節(jié)活性(6AB)。接下來,我們對MTImu亞群中SOX18TEAD2的活性進(jìn)行了評分,并觀察到大鼠肝細(xì)胞癌模型中的MTImu與肝細(xì)胞癌患者的MTImu之間具有高度一致性(6C)。

        為了驗(yàn)證這些因子在MTImu相關(guān)干性中的調(diào)節(jié)作用,我們使用siRNA敲擊法耗盡每個TF,并進(jìn)行球體形成實(shí)驗(yàn)來評估GPNMB+Gal-3+MTImu細(xì)胞的球體大小和形成效率。Sox18、YAPHDAC2的耗盡顯著降低了球體的形成效率(6DE)。此外,Lgals3Sox18Tead2被擊倒后下調(diào),而GPNMBHDAC2Sox18被擊倒后下調(diào)。為了驗(yàn)證SOX18在免疫抑制中的作用,我們在GPNMB+Gal-3+細(xì)胞中進(jìn)行了SOX18基因敲除和挽救實(shí)驗(yàn),并將其與血源性CD45+CD3+T細(xì)胞共同培養(yǎng)。事實(shí)上,與SOX18基因敲除的GPNMB+Gal-3+共培養(yǎng)顯著增加了CD8+GZMB+T細(xì)胞的百分比(6.22vs.。13.7%),而耗竭CD8+PD-1+T細(xì)胞比例(9.24%6.41%)降低。值得注意的是,在GPNMB+Gal-3+細(xì)胞中重新引入SOX18顯著降低了CD8+GZMB+T細(xì)胞的比例至9.13%,并有效地將耗盡的CD8+PD-1+T細(xì)胞恢復(fù)到15.6%(6FG)。綜上所述,這些結(jié)果再次證實(shí)了SOX18GPNMB+Gal-3+細(xì)胞的干性和免疫抑制中的重要作用。

        為了進(jìn)一步評估 Sox18 EPCAM+ 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用,我們將大約 1 × 10 8 EPCAM+ 細(xì)胞(WT 或通過慢病毒敲低 SOX18)注射到 DEN 治療的雄性大鼠中(圖 6H I)。 DEN 治療后 16 周時,SOX18 敲低組的腫瘤形成發(fā)生率和腫瘤大小均較 WT 組顯著減小(圖 6H I)。在腫瘤中 GFP+ 標(biāo)記的細(xì)胞中觀察到 SOX18 Gal-3 GPNMB 的共染色(圖 6J)。此外,Gal-3和帶有GFP+標(biāo)記的細(xì)胞的GPNMBSOX18敲低樣品中處于較低水平(圖6J)。此外,我們在 DEN 治療后 8 周或 12 周至 16 周期間通過 Sm4(一種已知的 SOX18 小分子抑制劑)抑制 SOX18。值得注意的是,為了評估 SOX18 對腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的作用,我們獲得了 DEN 暴露后 12 周和 16 周的肝組織。我們發(fā)現(xiàn)從第 8 周開始接受 Sm4 治療的大鼠的癌前病變明顯少于模擬組,在 DEN 治療后第 12 周,模擬組顯示出幾個小的、白色的囊腫樣病變,這表明 SOX18 的抑制顯著抑制了癌前病變的發(fā)生。 HCC。從 12 周開始接受 Sm4 治療的大鼠并未出現(xiàn)與模擬組一樣嚴(yán)重的腫瘤,這表明 SOX18 的抑制顯著抑制了 HCC 進(jìn)展。此外,在暴露于 DEN 16 周后的大鼠中,從 8 周開始抑制 SOX18 顯著減弱了內(nèi)源性 EPCAM+ 細(xì)胞的擴(kuò)增及其與 Gal-3、GPNMB AFP 的共染色。從第 12 周開始抑制 SOX18 并沒有顯著抑制內(nèi)源性 EPCAM+ 細(xì)胞的擴(kuò)增,但在 16 周后暴露于 DEN 的大鼠中顯著降低了 EPCAM+ 細(xì)胞與 Gal-3、GPNMB AFP 的共表達(dá)。結(jié)果驗(yàn)證了SOX18在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展以及EPCAM+細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的重要作用。

        隨后的綜合分析結(jié)合了 MTImmu 中上調(diào)的 1,400 個基因和 SOX18 1,746 個靶基因,確定了 353 個重疊基因。免疫抑制相關(guān)基因,包括 Ccl5、S100a9Gpnmb、Cd274、Lgals3 Mgp MTImmu 中明顯增加。實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng) (ChIP-qPCR) 測定表明 SOX18 有效結(jié)合 Cd274、S100a9 Cxcl2 的啟動子區(qū)域。此外,缺乏 SOX18 時這些基因的表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果表明,SOX18GPNMB+ Gal-3+ MTImmu亞群在惡性轉(zhuǎn)化過程中獲得免疫抑制能力所必需的。


 

 

7、SOX18、GPNMBGal-3的高表達(dá)與肝癌惡性程度的關(guān)系

        為了評估 SOX18GPNMB Gal-3 HCC 中的臨床相關(guān)性,我們首先使用癌癥基因組圖譜 (TCGA) HCC 數(shù)據(jù)集分析了 SOX18、GPNMB LGALS3 (Gal3) 的表達(dá)。與鄰近腫瘤組織(n = 160,圖 7A)相比,HCC 患者(n = 369)腫瘤中 SOX18GPNMB LGALS3 mRNA 水平均顯著增加。此外,GPNMBLGALS3之間觀察到強(qiáng)烈的正相關(guān)性(R2 = 0.11P = 0.043),以及GPNMBSOX18表達(dá)之間(R2 = 0.2,P < 0.0001)(圖7B)。

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證 SOX18、GPNMB Gal-3 (LGALS3) 的預(yù)后價值,我們對 157 例具有長期臨床隨訪記錄的 HCC 病例的組織微陣列進(jìn)行了這些蛋白的 IF 染色。值得注意的是,在鄰近腫瘤組織 (AT) 中觀察到 GPNMB、Gal-3 的表達(dá)升高以及與 SOX18 的共染色模式(圖 7C)。同時,在腫瘤(T)中也觀察到高蛋白水平的 GPNMBGal-3 以及與 SOX18 的共染色模式(圖 7D)。 GPNMBGal-3的表達(dá)與HCC患者的高復(fù)發(fā)率相關(guān)(P = 0.02)(圖7E)。此外,GPNMBGal-3水平高的HCC患者生存時間較短,而GPNMBGal-3水平低的HCC患者生存時間較長(圖7F)。總的來說,這些結(jié)果表明 GPNMB Gal-3 上調(diào)與 HCC 復(fù)發(fā)和不良預(yù)后存在病理關(guān)聯(lián)。


 

 

實(shí)驗(yàn)方法:

        scRNA-seqSCENIC分析、RNA速率分析、RT-PCR、ChIP-qPCR、慢病毒敲除。

參考文獻(xiàn):

        Meng Y, Zhao Q, Sang Y, et al. GPNMB+ Gal-3+ hepatic parenchymal cells promote immunosuppression and hepatocellular carcinogenesis. EMBO J. Published online November 27, 2023.