關聯(lián)CD4 +/CD8+ T細胞新抗原疫苗克服免疫檢查點阻斷劑抗藥性，實現(xiàn)腫瘤消退

        免疫檢查點阻斷療法（ICB）的治療效果目前僅限于被認為具有足夠腫瘤突變負荷（TMB）的癌癥亞群，這些亞群允許自體T細胞自發(fā)識別新抗原（NeoAg）。本研究探討了是否可以通過聯(lián)合免疫療法改善侵襲性低TMB鱗狀細胞腫瘤對ICB的反應，該療法使用功能明確的NeoAg作為內源性CD4+和CD8+T細胞的靶點。單獨接種CD4+或CD8+ NeoAg不能提供預防性或治療性免疫力，但含有這兩個亞群都能識別的NeoAg的疫苗能克服ICB抗性，并能根除包含PD-L1+ 腫瘤誘導癌干細胞（tCSC）亞群的已形成的大型腫瘤，前提是相關表位存在物理聯(lián)系。機制上，治療性 CD4+/CD8+ T 細胞 NeoAg 疫苗接種可改變腫瘤微環(huán)境 （TME），通過結合 ICB 介導的分子間表位擴散，使處于祖細胞和中間衰竭狀態(tài)的 NeoAg 特異性 CD8+ T 細胞數(shù)量增加。該研究于2023年9月發(fā)表在《The Journal of Clinical Investigation》，IF：15.9。

技術路線：

主要研究結果：

1. 基于內源性CD4+和CD8+T細胞反應性的新抗原功能鑒定

        用 1×107個照射過的SCC VII細胞（單獨或輔以 50 μg polyI:C）對C3H/HeJ 小鼠進行皮下注射免疫。免疫小鼠在14天后再接種 5×105個轉導表達熒光素酶和綠色熒光蛋白（SCC VII-Luc/GFP）的 SCC VII 活細胞，以實現(xiàn)生物發(fā)光（BLI）追蹤。雖然僅用輻照過的 SCC VII 進行全細胞免疫接種并不能保護小鼠在受到挑戰(zhàn)后免受腫瘤生長的影響--根據(jù)這一經典定義，SCC VII 是一種免疫原性很差的腫瘤--但通過多聚I:C的編碼遞送可以實現(xiàn)預防（圖1A和B）。因此，SCC VII 含有能夠產生保護性免疫的抗原。這取決于CD4+和CD8+ T 細胞，因為在接種疫苗之前（圖1C）或之后（圖1D），任何一個亞群的耗竭都會導致腫瘤在隨后的挑戰(zhàn)中生長。值得注意的是，與對照組相比，在接種前就被耗盡CD4+ T細胞的小鼠的腫瘤生長率降低，這表明在疫苗誘導反應的起始階段和接種后維持其療效都需要這種亞群。

圖1. SCC VII和polyI:C聯(lián)合免疫對肝臟腫瘤的侵襲具有保護作用

        隨后，對產生強烈 IFN-γ 反應的肽池進行去卷積，以檢測所針對的特定突變肽。分析結果顯示，SCC VII 的天然免疫反應識別出的突變基因包括 Pik3ca（Mut_44）、Cltc（Mut_48）、Ctnnd1（Mut_61）和 Otud5（Mut_65 和 Mut_67）（圖2A和B）。鑒定體細胞變異、選擇候選突變進行功能測試以及對 NeoAg 進行功能驗證所涉及的步驟用Circos圖表示（圖2C）。

圖2. SCC VII和polyI:C聯(lián)合免疫后基于功能的新抗原鑒定

        在檢測各NeoAg肽對觀察到的免疫的貢獻時，只有Mut_48 （CltcΔ15）顯示出對攻擊產生保護作用（圖3A），而WT肽（WT_48）無保護作用（圖3B）。這些數(shù)據(jù)表明T細胞對Mut_48的反應介導了預防性肽疫苗接種后的保護性免疫。

        評估分離自SCCⅶ腫瘤細胞免疫小鼠的CD4+和CD8+ T細胞的反應性，確定參與天然NeoAg特異性免疫應答的T細胞亞群。發(fā)現(xiàn)，Mut_48被CD4+和CD8+ T細胞識別，而Mut_44、Mut_61、Mut_65和Mut_67只能被CD4+ T細胞識別。此外，分離出的CD8+ T細胞識別Mut_72和Mut_73，這兩種肽在Slc26a11基因中含有相同的錯義突變（圖3D）。然而，在初次/加強接種后，Mut_72和Mut_73均無法在體內產生針對SCCⅶ的保護性免疫（圖3C）。這些結果表明，只有能被CD4+和CD8+ T細胞識別的Mut_48能夠通過多肽疫苗誘導有效的預防性免疫

圖3. CD4+和CD8+ T細胞對SCC vii衍生的新抗原反應的去卷積

        為確定每個亞群識別的表位是相同的還是不同的，使用 IFN-γ ELISPOT 定量對一組含有Mut_48 H129Q突變的10-mer和15-mer肽（命名為Mut_48.1-Mut_48.10）的相對反應量（圖4A）。從 SCC VII/polyI:C 免疫小鼠體內分離出的 CD8+ T 細胞在識別 Mut_48.10 10-mer 后產生的 IFN-γ 量最大，抗體阻斷表明它是由 H-2Kk 呈遞的（圖4B）。共純化的CD4+ T 細胞對通過 I-Ak 呈遞的 Mut_48.5 15-mer（圖4C）表現(xiàn)出最大的反應性，而對任何設計的 10-mer都沒有預期的反應（數(shù)據(jù)未顯示）。此外，使用免疫表位數(shù)據(jù)庫和分析資源（IEDB）NetMHCpan（v4.0）方法對 Mut_48衍生的 10-mer與H-2Kk的結合進行了硅預測，估計大多數(shù)肽的親和力較差，Mut_48.10 的最佳親和力為 4988.7 nM IC50。值得注意的是，盡管預測的 H-2Kk 結合 IC50 值高于大多數(shù)篩選方案使用的 500 nM 臨界值（圖4D），但Mut_48.7-48.10 系列中包含的 10-mer肽仍能誘導 IFN-γ 生成。這些結果進一步證實，Mut_48 在較長的CD4+ T 細胞表位Mut_48.5 中包含一個 CD8+ T 細胞最小表位Mut_48.10，從而賦予這兩個T細胞亞群產生 IFN-γ 的能力（圖4E）。對刺激IFN-γ 的Mut_72和Mut_73的H-2Kk 結合預測進行擴展分析后，發(fā)現(xiàn)這兩種肽的IC50親和力均為250.9 nM，這表明IEDB NetMHCpan（v4.0）工具算法在過濾 CD8+ T 細胞體外免疫活性方面的效率約為 66%（圖4F）。因此，本研究利用無偏見的功能性方法鑒定 NeoAg 使其能夠在同一檢測系統(tǒng)中更有效地探測CD4+和CD8+ T細胞表位。

        免疫研究表明，含有CD4+和CD8+ T細胞識別的最小表位的Mut_48.5 15-聚合體對體內活 SCC VII 細胞挑戰(zhàn)的保護程度與 Mut_48 20-聚合體相當。此外，CD4+ T 細胞表位對于觀察到的保護作用是完全必要的，因為用僅含有 CD8+ T 細胞表位的截短 Mut_48.10 10-mer 免疫小鼠有部分保護作用（圖 4G）。

圖4. CD4+和CD8+ T細胞疫苗衍生表位的MHC限制和功能相互作用

2. CD4+T細胞的腫瘤特異性和對CD8+T細胞的幫助

        通過三重丙氨酸重復（-AAA-）共價連接 CD4+ 和 CD8+ T 細胞抗原，與由無系肽組成的疫苗接種相比，Mut_48 對 SCC VII 挑戰(zhàn)的保護效果更佳（圖 5）。因此，Mut_48 的功效與 CD4+ T 細胞輔助抗原以及腫瘤特異性 CTL NeoAg 的呈現(xiàn)有關，很可能是由相同的APC呈現(xiàn)的。此外，這些結果表明，CD4+ T 細胞需要腫瘤特異性的其他效應功能在該模型中是可有可無的。

圖5. 栓系CD4+ T細胞輔助性和最小CD8+ T細胞表位疫苗盡可能抑制SCCⅶ腫瘤生長

3. 結合新抗原疫苗接種可克服免疫檢查點阻斷的治療耐藥性

        有研究表明，ICB 單藥治療可擴大內源性 NeoAg 特異性 T 細胞反應，并在與基于預測的疫苗聯(lián)合使用時產生新的 NeoAg 反應，從而提高患者的無進展生存期。評估了基于已驗證靶點的 NeoAg 疫苗能否與這一策略合理結合。首先使用上述原代/加強方案，通過免疫集合 NeoAg 疫苗（靶向 Pik3ca、Cltc、Ctnnd1 和 Otud5 突變）誘導 NeoAg 特異性 T 細胞應答?；铙w SCC VII-Luc/GFP 腫瘤挑戰(zhàn)三天后，小鼠通過靜脈注射 PD-1 或 CTLA-4 阻斷抗體，并測量其對腫瘤生長的影響。在這兩種情況下，與單獨使用 ICB 相比，ICB 都能明顯加快 NeoAg 疫苗對生長中的 SCC VII 腫瘤產生治療性免疫的能力。將 ICB 與多肽疫苗結合使用可防止約 50% 的單獨接種 NeoAg 的C3H/HeJ小鼠晚期（超過第 24 天）SCC VII 腫瘤復發(fā)（圖 6A 和 B）?？筆D-1和NeoAg聯(lián)合疫苗接種明顯加速了可觸及腫瘤的消除，在第14天活動性排斥的早期動力學階段協(xié)同效應明顯（圖6A）。此外，通過IFN-γ ELISPOT檢測NeoAg疫苗接種后第42天的記憶T細胞反應，發(fā)現(xiàn)PD-1阻斷增加Mut_48特異性T細胞反應的幅度，并顯示分子間表位擴散到Mut_72和Mut_73的證據(jù)（圖6C和D），這些靶點沒有包括在多肽疫苗接種中，但以前曾觀察到它們在與CD4+ T細胞物理分離后引起CD8+ T細胞反應（圖3D）。相反，抗 CTLA-4 處理既沒有顯示協(xié)同作用，也沒有顯著影響 Mut_48 特異性 T 細胞的絕對數(shù)量。此外，抗 CTLA-4 還減少表位向其他特異性的擴散（圖 6B）。

圖6. 抗PD-1檢查點阻斷增加CltcΔ15-specific記憶頻率，并促進分子間優(yōu)勢表位的擴散

        SCC VII-Luc/GFP腫瘤在小鼠群中生長，使其體積達到約300至400立方毫米，然后在第10天和第24天用對側靜脈注射Mut_48+polyI:C混合物和/或靜脈注射抗PD-1治療2個周期。單獨使用Mut_48疫苗并不能帶來治療效果，而抗PD-1則表現(xiàn)出不同程度的原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥性，有時只能導致最初的腫瘤控制，但隨后就會喪失。與此相反，將 PD-1 阻斷與 Mut_48 NeoAg 疫苗結合使用，可以完全、持久（超過90天）地根除已形成的大腫瘤（圖7A-D）。體外再刺激脾臟和腫瘤引流Ig LN的淋巴細胞發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合使用NeoAg和抗PD-1可協(xié)同增強記憶期Mut_48特異性T細胞反應（圖7E）。此外，在第一輪免疫療法后的第 17 天效應期分離的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）組分中，NeoAg 和抗 PD-1 聯(lián)合給藥顯著增加總 CD8+ T 細胞的數(shù)量，而常規(guī)（Tconv）和調節(jié)性（Treg）CD4+ T 細胞的數(shù)量保持不變（圖7F）。Mut_48 和抗 PD-1 治療對腫瘤的排斥也伴隨著對 SCC VII 向區(qū)域 LN 轉移的抑制（圖7G）。這些數(shù)據(jù)表明，功能性 NeoAg 介導的腫瘤排斥和區(qū)域轉移預防在與 ICB 結合使用后具有最佳治療效果。

圖7. 抗PD-1和CltcΔ15的延遲聯(lián)合治療可促進已建立的SCCⅶ腫瘤的清除

4. 新抗原疫苗接種增加干細胞樣和中間耗竭的CD8+T細胞的存在

        在腫瘤接種后第 10 天，用 Mut_48 + polyI:C混合物和/或i.p.抗PD-1對 SCC VII 腫瘤小鼠進行s.c.處理，在第 17 天效應期從 TIL、脾細胞和腫瘤排出的 Ig LN 分餾物中純化 CD45+ 細胞，并進行 FACS 處理。將來自所有器官的入選 T 細胞合并在一起，并使用 21 種已知的表型特征將其投射到UMAP空間，以定義naive CD4+/CD8+ T 細胞（Tn）、CD4+/CD8+ Teff/mem、CD4+ Treg、CD8+ Tprec/prog、CD8+ Tex-int 和 CD8+ Tex-term 亞群。總CD4+和CD8+T 細胞得到清晰的分離（圖 8A）。來自 TIL、脾臟和 LN 的 CD8+ T 細胞亞群似乎完全不同，而來自TIL和LN的CD4+ T細胞似乎占據(jù)與脾臟類似的獨立空間（圖8B上）。當單獨觀察TIL定位與治療的關系時，可以觀察到Mut_48疫苗接種與特定CD4+和CD8+T細胞亞群消失之間的密切聯(lián)系，而相對于單獨的polyI:C治療，抗PD-1治療要么引起更微妙的變化，要么似乎擴大先前存在的亞群（圖 8B下）。

        為更詳細地了解治療是如何影響 T 細胞分化的，確定24個元集群，它們捕捉到在整個 UMAP 區(qū)域觀察到的標記物特征的粒度（圖8C和D）。該圖譜顯示，各器官的治療捕獲了CD8+Tex、Teff 和Tmem系，其中門控CD8+ T 細胞的偽時間軌跡分析顯示CD62L（Tn和Tmem）、TCF-1/SLAMF6（Tprec/prog 和 Tmem）、GzmB/CX3CR1/CD44/Ki-67（Tex-int 和 Teff）和 TOX/PD-1（Tex-int 和 Tex-term）之間高度協(xié)調的表達模式（圖 8E）。 根據(jù)這些標準確定CD8+ Tex-int（元簇 7、10、12、13、18、21 和 22）和 CD8+ Tex-term（元簇17和19）（圖 8C-F）。

圖8. 腫瘤和外周淋巴器官中CD4+和CD8+ T細胞亞群的鑒定

        接下來，根據(jù)TIL（圖 9A和B）、脾臟（圖 10A和B）和腫瘤引流 Ig LN（圖 10C和D）中各處理間 CD4+ T 細胞或 CD8+ T 細胞的頻率對元集群進行解析。在 24 個元集群中，發(fā)現(xiàn) 4個CD4+ T 細胞相關元集群和 6個CD8+ T 細胞相關元集群相對于 TIL 中單獨的polyI:C 處理具有統(tǒng)計學意義。在 CD4+ TIL 中，與接種 Mut_48 疫苗相關的 Tn 和 Teff/mem 細胞（元簇 1、2 和 9）顯著減少，這與 T 細胞引誘作用一致。Mut_48 疫苗接種導致 CD4+ Teff/mem 元簇 8 的增加，根據(jù) PD-1 和 ICOS 表達的增加，這似乎可能是 T 濾泡輔助細胞（Tfh）的來源（圖 8F 和圖 9B）。在所有器官和治療中，CD4+Teff/mem（非Treg）沒有顯示細胞毒性標記（KLRG-1和GzmB），這與它們在該模型中作為輔助細胞的作用一致（圖8D和F）。在 CD8+ TIL 中，與 Mut_48 疫苗誘導引物相關的 Tn（元簇 14）減少。抗 PD-1 治療似乎足以導致 Tprec/prog 亞群（元簇 6 和 20）的擴大。單用抗-PD-1（元簇 18）、Mut_48 和抗-PD-1 組合（元簇 12 和 21）或任一處理（元簇 22）都能支持特定的Tex-int 亞群。單獨接種Mut_48 疫苗后，Tex-term亞群（元簇 17 和 19）被觀察到擴大；然而，抗-PD-1 治療阻止這一現(xiàn)象，已知抗-PD-1 會動員 PD-1- Tn 和 PD-1lo Tprec/prog，而犧牲 PD-1hi Tex-term細胞（圖 8F 和圖 9B）。雖然 Mut_48 和抗 PD-1 聯(lián)合治療支持 TIL 中的 Tprec/prog 分化與單獨治療相比沒有差異，但聯(lián)合治療后脾臟和腫瘤引流 Ig LN 中的小群 Tprec/prog（元簇 20）顯著擴大（圖 10A-D）。這些數(shù)據(jù)表明，將 PD-1 阻斷與 NeoAg 肽疫苗接種相結合會導致非細胞毒性、輔助性 CD4+ T 細胞亞群的增長，并更有效地擴增外周的 CD8+Tprec/prog 和 TIL 部分中的 Tex-int 群體。

圖9. CltcΔ15疫苗增強抗PD-1誘導的CD8+T細胞應答，并將其重新聚焦于腫瘤中的中間型、效應樣亞群

10. 聯(lián)合抗PD-1和CltcΔ15擴增外周淋巴器官的前體/祖細胞和中間耗竭的CD8+T細胞

5. 新抗原疫苗的療效需要CD4+ T細胞提供 Th1 型幫助

        在接種 NeoAg 肽疫苗前消耗CD4+ T細胞會導致部分腫瘤控制，這表明在 CD4+ T細胞缺失的情況下啟動的CD8+ T細胞并不完全有效，而在治療前消耗 CD8+ T細胞會導致腫瘤快速生長，這表明 CD8+ T 細胞是抗 SCC VII 的必需效應因子。在CD4+ T細胞完全缺失的情況下，激動抗CD40交聯(lián)抗體完全恢復了CD8+ T細胞介導的腫瘤排斥反應（圖11A），這表明即使在CD4+ Tfh缺失的情況下，提供基于Th1的細胞幫助也是有效治療的關鍵特征。與此相一致，在疫苗/PD-1阻斷治療聯(lián)合方案中，當與 CD8+ T 細胞最小表位（Mut_48.10）相連時，Cltc CD4+ T 細胞表位可被 PADRE（X） 替代，并仍能導致完全的腫瘤排斥反應（圖 11B）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，功能合理的 NeoAg疫苗聯(lián)合療法可以有效克服不同類型的腫瘤耐藥機制（無論是對化療還是檢查點阻斷單藥）。

圖11. 栓系CD4+ T細胞輔助表位通過CD40依賴機制優(yōu)化檢查點阻斷和CTL介導的SCCⅶ腫瘤破壞

結論

        綜上所述，本研究證明ICB抗藥性可以通過與NeoAg疫苗接種相結合的協(xié)同機制有效克服，從而維持穩(wěn)定的 CD8+ T 細胞應答，這種應答能夠抵御終末衰竭的發(fā)生，并同時靶向PD-L1+ 和 PD-L1-腫瘤細胞?？衫帽疚奶剿鞯母拍顏黹_發(fā)更有效的個性化癌癥疫苗，從而擴大ICB可治療的腫瘤范圍。

實驗方法

        細胞培養(yǎng)，基于腫瘤和肽的免疫和疫苗接種，化療，抗體介導的檢查點阻斷、CD4+/CD8+ T細胞清除以及對輔助依賴性的評估，腫瘤、脾臟和Ig LN單個核細胞分離，Q-PCR，WB，ELISPOT，Whole-animal成像，流式細胞術，光譜數(shù)據(jù)處理與分析，共聚焦顯微鏡，傷口閉合實驗，Exome-Seq和RNA-Seq，生物信息學NeoAg鑒定，生物信息學分析小鼠與人類RNA-Seq數(shù)據(jù)集的匹配，

參考文獻

        Dolina JS, Lee J, Brightman SE, McArdle S, Hall SM, Thota RR, Zavala KS, Lanka M, Ramamoorthy Premlal AL, Greenbaum JA, Cohen EEW, Peters B, Schoenberger SP. Linked CD4+/CD8+ T cell neoantigen vaccination overcomes immune checkpoint blockade resistance and enables tumor regression. J Clin Invest. 2023 Sep 1;133(17):e164258. doi: 10.1172/JCI164258. PMID: 37655661; PMCID: PMC10471175.