附睪核糖核酸酶T2通過附睪體-精子相互作用參與弱畸形精子癥和影響代際的代謝紊亂

        附睪對于睪丸后精子的發(fā)育是至關重要的，這被稱為精子成熟。在這個過程中，通過蛋白質和小的非編碼RNA（sncRNAs）的交換，附睪與精子之間有了交流從而獲得了受精能力。更重要的是，附睪上皮細胞分泌的附睪源外泌體將sncRNAs轉移到成熟的精子中。這些單鏈RNA可以調節(jié)代際遺傳，從而進一步影響后代的健康。近年來，精子成熟過程中sncRNAs與精子功能調控的聯系和機制日益受到人們的關注。建立附睪特異性核糖核酸酶T2（RNaseT2）敲入（KI）小鼠模型，探討其在精子受精能力發(fā)育中的作用。對RNase T2 KI雄性的精子參數進行了評估，并對其后代的代謝表型進行了表征。Pandora測序技術對精子sncRNAs的表達模式進行了分析和測序，以確定附睪部RNase T2對精子sncRNAs表達水平的影響。此外，在體外和體內都證實了RNase T2在附睪上皮細胞中的表達水平與環(huán)境應激的反應。RNase T2的過度表達會導致小鼠附睪頭部嚴重的生育能力低下，并與弱畸精子癥相關，并進一步導致后代獲得性代謝紊亂，包括高血糖、高脂血癥和高胰島素血癥。Pandora測序顯示，與對照精子相比，RNase T2 KI精子中sncRNAs特別是rRNA衍生的小RNA（rsRNA）和tRNA衍生的小RNA（tsRNA）譜發(fā)生了改變。此外，環(huán)境壓力上調附睪頭中的RNase T2。

        本文于2023年11月發(fā)表在《BMC Medicine》雜志上，IF=9.3

主要技術路線：

1、在精子成熟過程中，附睪頭中的RNase T2可通過附睪小體（附睪衍生的外泌體）轉移至精子

        我們之前的研究報道了RNase T2在人和小鼠精子中的表達。在此，聚集的RNase T2位于精子的頂體后區(qū)域（圖1A），在成熟過程中，外泌體通過附睪時與精子融合。免疫印跡分析表明，RNase T2蛋白在頭精子首次進入附睪部時存在于中等水平，而在尾部精子中表達較豐富（圖1B）。附睪成熟過程中精子中RNase T2水平的升高及其在精子中的定位特征表明，分泌的RNase T2在附睪轉運過程中被轉運到成熟的精子中。

        隨后，采用免疫印跡法和免疫熒光法研究RNase T2在小鼠睪丸和附睪中的表達規(guī)律。值得注意的是，據報道，核糖核酸酶T2在人類細胞和小鼠組織中以多種形式存在，即36 kDa條帶代表全長、糖基化和分泌型，而27 kDa和31 kDa條帶是蛋白水解物。在此，對小鼠睪丸和附睪中RNaseT2的免疫印跡法分析表明，RNase T2在近40 kDa處有預期的條帶（圖1C），代表其糖基化的全長形式。因此，我們的結果表明，RNase T2在附睪頭的表達尤其高于在睪丸或附睪尾的表達（圖1C）。同時，免疫熒光分析顯示，附睪頭RNaseT2主要分布在面對附睪上皮腔的主細胞的頂下區(qū)，這與附睪頭的分泌特征一致（圖1D）。

        由于RNase T2定位于頂體后區(qū)域（圖1A），附睪來源的外泌體在此處與精子融合，因此我們可以想知道外泌體是否介導RNase T2向精子的轉移。通過聚合物沉淀分離附睪液中的外泌體，并通過透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析和蛋白質印跡分析進行驗證。通過納米顆粒追蹤分析檢測到的這些附睪來源的外泌體的直徑在50至150 nm范圍內（圖1E），這與外泌體的定義一致。通過透射電子顯微鏡觀察到的外泌體的超微結構（圖1F）顯示出明顯的雙層膜結構，同時直徑約為50至100 nm，這與納米顆粒跟蹤分析檢測到的一致。此外，蛋白質印跡顯示，分離的外泌體富含外泌體標記物TSG101和Flotillin 1，而它們不顯示鈣聯蛋白（一種內質網蛋白）（圖1G）。正如預期的那樣，RNase T2存在于這些分離的附睪來源的外泌體中（圖1G）。此外，RNase T2和外泌體富集的脂筏蛋白Caveolin 1的免疫熒光染色表明，這兩種蛋白從頭精子到尾精子的聚集顯著更多，并且它們特別共定位于尾精子的頂體后區(qū)域（圖1H）。RNase T2和Caveolin 1的共定位表明RNase T2可能通過外泌體遞送過程轉運到成熟的精子。

        還研究了RNA-SET2與人精漿中外泌體之間的關聯。蛋白質印跡和透射電子顯微鏡證實外泌體源自人精漿。此外，RNA-SET2的蛋白質印跡分析顯示其存在于精液樣本的不同部分中，即精子、精漿和從精漿中分離的外泌體。同時，膠體金標記和免疫電鏡分析表明，RNA-SET2標記的免疫金顆粒主要局限于外泌體樣囊泡，這些囊泡往往在精子的頂體后和中段區(qū)域與精子融合。免疫熒光分析顯示，RNA-SET2與Caveolin 1在人精子中共定位，這與小鼠精子中的一致。綜上所述，人類精子中的RNA-SET2可能是通過精子-外泌體相互作用從精漿衍生而來。

        綜上所述，這些結果表明RNase T2在附睪頭高度表達，并至少部分以外泌體依賴性方式分泌到附睪液中。因此，它在附睪運輸過程中被轉運到成熟的精子中（圖1I）。

圖1 附睪頭中的RNase T2可以通過釋放外泌體到精漿中轉移到精子中

2、附睪頭RNase T2的條件敲入（KI）

        為了確定附睪頭RNase T2對精子成熟的影響，構建了基于Rosa26-Cre的基因敲入小鼠模型。Rosa26-pCAG-STOP-RNase T2小鼠與附睪頭的主細胞特異性Cre小鼠系（Lcn5-Cre）雜交。因此，在Rosa26-RNaseT2條件性敲入（KI）小鼠（rosa26-RNASET2loxP/loxP；Lcn5Cre+）中，Cre介導的條件性NeoSTOP片段的去除導致CAG啟動子驅動的RNase T2在附睪頭的主細胞中表達。免疫印跡和免疫熒光分析均證實RNase T2在KI小鼠附睪頭和成熟精子中的表達顯著增加，證實了RNase T2在這些KI小鼠中過表達。值得注意的是，免疫熒光分析表明，在RNaseT2 KI精子中，RNase T2主要聚集在精子頭部的頂體后區(qū)域。RNase T2 KI雄性小鼠健康，發(fā)育正常。組織學分析也表明，與野生型（WT）小鼠相比，這些小鼠的睪丸和附睪體沒有明顯的缺陷。然而，對照組（Rosa26-RNASET2loxP/loxP，Cre陰性）小鼠和RNaseT2 KI小鼠的血清睪酮、抗精子抗體和附睪炎性細胞因子的濃度沒有顯著差異。提示該RNaseT2 KI小鼠模型適用于附睪頭的RNaseT2功能的研究。

3、RNaseT2 KI小鼠雄性不育率和精子質量下降

        為了評估RNase T2 KI小鼠的繁殖力，每只雄性小鼠與兩只性成熟雌性小鼠交配1周，然后比較妊娠率和產仔數與WT和對照組小鼠的受孕率和產仔數。正如預期的那樣，RNase T2 KI 雄性性行為活躍，并在雌性伴侶中產生陰道塞。在21天的懷孕期內，18只雌性與RNase T2 KI雄性交配，平均只有4只雌性懷孕并產下近3只幼崽（圖2A）。與RNase T2 KI 雄性交配的雌性的妊娠率（4/18）和產仔數（2.67 ± 0.58, n=4, P < 0.05）均顯著低于與WT雄性交配的雌性（妊娠率, 18/ 18；產仔數，8.61 ± 0.92，n=18）和對照雄性（懷孕率，17/18；產仔數，7.94 ± 1.98，n=17）（圖2A）。因此，如此極低的妊娠率和產仔數清楚地表明，RNase T2 KI 雄性被認為反映了嚴重的生育能力低下。

        計算機輔助精子分析（CASA）和形態(tài)學分析評估了附睪尾成熟精子的精子參數。結果表明，WT雄性、對照雄性和RNase T2 KI雄性之間精子濃度沒有顯著差異。然而，盡管RNase T2 KI小鼠的精子活力和前向運動在獲能30分鐘和60分鐘期間稍大，但RNase T2 KI雄性小鼠的活動精子和前向活動精子的百分比明顯低于WT和對照雄性（圖2B，C）。這種活力的增加表明，RNase T2 KI精子對獲能有反應，但仍處于相對較低的水平，遠遠不能滿足受精的要求。

        此外，質膜流動性、細胞內鈣水平和線粒體活性被用來評估精子獲能能力。用流式細胞術分析，WT精子和RNase T2 KI精子都有很高比例的部花青540（MC540）熒光信號。同時，熒光強度測定WT精子和RNase T2 KI精子細胞內鈣離子水平和線粒體膜電位高氯酸四甲基羅丹明甲酯（TMRM）染色的結果無顯著差異。另一方面，鈣離子載體A23187誘導的RNase T2 KI精子頂體反應的發(fā)生率也與WT和對照精子相同。這些結果表明，RNase T2 KI精子的獲能和頂體反應與WT精子相同。

        值得注意的是，通過瑞氏-吉姆薩染色（圖2E）進行評估發(fā)現，RNase T2 KI精子的精子頭部畸形率（79.06±8.42%，n=20）顯著高于WT精子（8.17±0.98%，n=16）和Rosa26/Cre-精子（6.86±1.74%，n=17）（圖2D）。同時，電子顯微鏡分析顯示，RNase T2 KI精子的精子頭部有膨脹的細胞質（圖2F），因此細胞質膜、頂體和細胞核彼此不貼合。RNase T2 KI精子中精子頭部的這種嚴重畸形形態(tài)被稱為畸形精子癥。這種情況可能是精子活力差和男性生育能力低下的原因。另一方面，TEM圖像表明，與對照小鼠相比，RNase T2 KI附睪頭的精子表現出正常的形態(tài)。這種差異表明，RNase T2 過度表達可能會導致附睪成熟過程中的精子畸形。

        此外，輔助生殖技術表明體內胞漿內單精子注射（ICSI）可以幫助RNase T2 KI精子受孕，而體外受精（IVF）則無效（圖2G）。這種差異表明，RNase T2 KI精子可以使卵母細胞受精，但由于運動能力差而無法到達卵母細胞。

圖2 RNase T2 KI 小鼠的雄性生育能力和精子質量較差

4、精子中的人類RNASET2與精子質量呈負相關

        我們前期的研究表明，精液中RNase T2的表達與精子活力呈負相關。這種反比關系被認為是人類弱精子癥的一個指標。在此，我們進一步表征了RNASET2與精子畸形之間的潛在相關性。每組的供體人群為63名健康男性和44名弱畸精子癥男性。免疫熒光染色和流式細胞儀分析鑒定了人類精子中的RNASET2含量。熒光分析顯示，與健康捐獻者相比，弱精子癥個體（n = 44）的精子被標記有更高的熒光強度（n=63，P<0.01）。

        同時，進一步分析了不同精子群體中RNASET2的含量。每個精液樣本中的兩個精子群用Percoll梯度分離，即質量好的成熟精子用90% Percoll分離，質量差的未成熟精子用45% Percoll分離。免疫熒光分析顯示，與90% Percoll分離的質量良好的精子相比，45% Percoll分離的質量較差的精子被更高的RNASET2熒光強度標記（n=16，P<0.01）。此外，免疫熒光分析還顯示RNASET2強烈聚集在頭部變形精子的頂體后區(qū)域，即小頭（HS）、小錐形頭（HST）、小無定形頭（HSA）、小空泡頭（HSV）、大頭（HL）、大圓頭（HLR）、大梨形頭（HLP）、大不定形頭（HLA）。

        此外，ELISA檢測精漿中RNASET2含量也顯示，與健康精液標本（17.07±4.48 μg/mL，n=44，P<0.05）相比，弱畸精子癥個體精漿中RNASET2表達量（24.43±4.39 μg/ mL，n=63）顯著升高。

        總的來說，結果表明，附睪頭中RNase T2的過度表達導致精子頭部形態(tài)更加嚴重的畸形，這可能進一步損害精子的活力和受精能力。

5、RNase T2 KI小鼠將父系獲得性代謝紊亂遺傳給F1后代

        據報道，環(huán)境壓力導致代際代謝異常。為了證實RNase T2誘導的弱畸精子癥是否也介導代際遺傳，將RNase T2 KI小鼠與WT雌性小鼠交配以產生第一代子代（F1）（圖3A）。然后，分析了RNase T2 KI小鼠（RNase T2 KI-F1）和對照小鼠（Control-F1）后代的代謝表型。結果表明，RNase T2 KI-F1小鼠，無論是6周齡的雄性還是雌性，都比年齡匹配的對照F1小鼠顯著重（圖3B，C），同時，20周齡的RNase T2 KI-F1小鼠的血糖水平也顯著升高（圖3D，E）。由于雄性F1在體重和血糖水平上表現出更顯著的變化，因此選擇雄性后代進行以下實驗。

        隨后，為了更廣泛地研究后代的代謝表型變異，20周齡的雄性F1后代被用于以下實驗。結果表明，RNase T2 KI-F1小鼠血清胰島素和C-肽水平顯著升高，而胰高血糖素水平顯著下降（圖3F-H）。難以降解的胰島素原C肽片段是準確劃分胰島細胞功能的指標。我們的結果表明，RNase T2 KI-F1小鼠的葡萄糖代謝和高血糖受到破壞。此外，葡萄糖耐量試驗（GTT）結果顯示，RNase T2 KI-F1小鼠的血糖和胰島素水平較高（圖3I，J）。這些上升表明，與年齡匹配的對照F1小鼠相比，RNase T2 KI-F1小鼠的葡萄糖耐量受損。RNase T2 KI-F1小鼠的這種葡萄糖代謝紊亂的出現肯定源于RNase T2 KI小鼠的精子中的父系因素。然而，胰島素耐量試驗（ITT）結果在RNase T2 KI-F1小鼠和對照F1小鼠之間沒有顯著差異（圖3K）。這一相似性與以前研究報告的一致。

        糖平衡失調和脂代謝失調總是同時發(fā)生的。例如，胰島素抵抗會導致血脂異常。因此，對RNase T2 KI-F1小鼠和對照F1小鼠的血脂水平進行了比較分析。在RNase T2 KI-F1小鼠中，它們的高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（T-CHO）、非酯化脂肪酸（NEFA）和甘油三酯（TG）水平上升。這些增加表明RNase T2 KI-F1小鼠出現了脂代謝紊亂和高脂血癥（圖3L-P）。由于瘦素和脂聯素的水平反映了脂肪細胞的功能，我們還發(fā)現它們的血清水平在RNase T2 KI-F1小鼠中顯著升高（圖3Q，R）。幾項研究證明，當身體脂肪百分比增加時，血清瘦素水平的升高會抑制進食并加速新陳代謝，而分泌的脂聯素的增加也會改善胰島素抵抗。因此，這些結果與我們的發(fā)現是一致的，即RNase T2 KI-F1小鼠的體重比對照F1小鼠的體重要重。

        綜上所述，我們的數據有力地證明了附睪頭中的RNase T2在誘發(fā)子代遺傳性代謝紊亂方面發(fā)揮了重要作用。

圖3 RNase T2 KI 的 F1 發(fā)生糖脂代謝紊亂

6、RNase T2 KI誘導F1后代肝臟mRNA表達模式的變化

        為了進一步探討KI小鼠肝臟RNase T2功能的生物學影響，我們進行了RNA測序（RNA-seq）并比較了10周齡和20周齡RNase T2 KI小鼠和對照小鼠的肝臟基因表達譜（圖4A-E）。結果顯示，與對照F1小鼠相比，10周齡小鼠的肝臟中RNase T2 KI-F1小鼠的肝臟中有10個基因上調，而25個基因下調。然而，與對照組相比，20周齡時有57個基因上調，83個基因下調。基因本體（GO）功能分析證明的差異表達基因（DEG）在20周時在RNase T2 KI-F1和對照-F1之間的脂質代謝過程中富集（圖4F）。此外，還測定了兩組20周齡小鼠之間一些與葡萄糖和脂質代謝相關的DEGs的表達水平。胰島素樣生長因子結合蛋白1（IGFbp1）、胰島素受體底物2（Irs2）、Perilipin-4（Plin4）、血管生成素樣4（ANGPTL4）、鋅指和含16個BTB結構域（Zbtb16）的表達通過RT-qPCR進一步證實（圖4G）。由于Igfbp1和Irs2與胰島素分泌和胰島素信號轉導有關，本研究的RT-qPCR結果證實RNase T2 KI-F1小鼠的Igfbp1和Irs2水平顯著降低。相反，有助于脂滴形成和功能的Plin4水平反而顯著增加（圖4G），表明RNase T2 KI-F1小鼠中脂滴水平顯著上調。

        此外，數據的火山圖顯示了RNase T2 KI-F1發(fā)育過程中肝臟mRNA表達的差異（圖4C）。10周齡的RNase T2 KI-F1和20周齡的RNase T2 KI-F1之間存在大量DEG。這些DEG還在20周時的RNase T2 KI-F1和對照-F1之間的DEG中鑒定出，例如Angptl4和Plin4。對10周齡RNase T2 KI-F1和20周齡RNase T2 KI-F1之間的DEG進行GO分析，揭示了它們參與葡萄糖和脂質代謝，特別是參與B型胰腺細胞發(fā)育、糖原生物合成的調節(jié)過程，以及類固醇代謝過程和膽固醇代謝過程的調節(jié)（圖4H）。

        總而言之，這些結果證實，頭附睪中的RNase T2 KI表達可能會誘發(fā)后代的代謝紊亂，并且這種紊亂隨著年齡的增長而變得越來越明顯。這種關聯表明附睪RNase T2參與介導代際遺傳。

圖4 RNase T2 KI誘導F1后代肝臟mRNA表達變化

7、RNase T2 KI精子中sncRNA的表達水平發(fā)生變化

        我們更多地思考了RNase T2 KI-F1小鼠附睪頭中RNase T2的表達如何促進代謝紊亂的遺傳。為了解決這個問題，對從RNase T2 KI小鼠和對照小鼠中分離的精子進行了小RNA測序分析（圖5A）。小RNA-Seq結果顯示，兩組總檢測到的rRNA衍生小RNA（RsRNAs）的11.8%和總檢測到的tsRNAs的15.3%發(fā)生了顯著變化（5B、C）。同時，microRNAs（MiRNAs）和piRNAs的豐度變化分別只有5.98%和不到0.02%（圖5D，E）。此外，在改變的1884個tsRNA中，有973個在RNase T2 KI小鼠的精子中上調，910個在精子中下調。

        RNase T2是一種核糖核酸酶，參與單鏈RNA的生成，如tsRNAs和rsRNAs。tsRNAs最近被發(fā)現是表觀遺傳信息的代際載體。據報道，tsRNAs由幾種核糖核酸酶處理，包括Dicer、ANG和RNase T2。在本研究中，我們使用RT-qPCR和免疫印跡法檢測了這三種核糖核酸酶在附睪頭中的表達水平（圖5F，G）。結果表明，RNase T2在該組織中的表達顯著高于Dicer和ANG（圖5F，G）。因此，在RNase T2和KI精子中，sncRNAs的表達水平發(fā)生了變化，RNase T2可能是調節(jié)精子中sncRNAs水平的主要核糖核酸酶。

圖5 RNase T2 KI精子中sncRNA表達水平的變化

8、應激條件上調附睪上皮細胞RNase T2的表達

        多項研究表明炎癥或氧化應激可以激活并誘導RNase T2核糖核酸酶活性。在這里，我們研究了體外和體內環(huán)境應激對附睪RNase T2表達的影響。一方面，對來自附睪頭的原代附睪上皮細胞（EEC）進行了原代培養(yǎng)（圖6A）并鑒定。免疫熒光分析顯示EEC中的RNase T2與外泌體標記物Flotillin 1共定位（圖6B）。這種關聯表明外泌體可以介導RNase T2分泌。同時，蛋白免疫印跡分析證實從EEC培養(yǎng)基中分離的外泌體中存在RNase T2。此外，在炎癥誘導劑脂多糖（LPS）和氧化應激誘導劑H2O2存在的情況下，EEC（圖6C）和外泌體（圖6D）中的RNase T2表達顯著增加。另一方面，LPS處理上調了附睪頭中RNase T2的表達（圖6E、F）。此外，在炎癥小鼠中，附睪來源的外泌體中其含量也有所增加（圖6G）。

圖6 應激條件會誘導附睪上皮細胞中RNase T2的上調

        因此，這些結果表明，暴露于環(huán)境應激可以增加附睪上皮細胞和外泌體中附睪RNase T2的表達。

        附睪RNase T2在誘導精子成熟和代際遺傳中的重要性得到了證明。附睪頭中過度表達的RNase T2會導致后代的弱畸精子癥和代謝紊亂。

實驗方法：

        小RNA測序，肝臟轉錄組分析，蛋白質印跡分析，免疫熒光分析，外泌體提取及鑒定，透射電子顯微鏡分析，酶聯免疫吸附測定，線粒體膜電位測定，RNA提取、逆轉錄和定量PCR分析，細胞的分離、培養(yǎng)及處理，流式細胞術，小鼠模型，組織學分析，生育能力評估，精子參數分析，體內葡萄糖耐量試驗(GTT)，體內胰島素耐量試驗(ITT)，代謝指標分析

參考文獻：

        Ma Z, Li J, Fu L, Fu R, Tang N, Quan Y, et al. Epididymal RNase T2 contributes to astheno-teratozoospermia and intergenerational metabolic disorder through epididymosome-sperm interaction. BMC Med. 2023;21(1):453. Epub 2023/11/23. doi: 10.1186/s12916-023-03158-1. PubMed PMID: 37993934; PubMed Central PMCID: PMCPMC10664275.