外泌體lncAKR1C2編碼的微蛋白通過調(diào)節(jié)脂肪酸代謝促進(jìn)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

        淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(Lymph node metastasis, LNM)是胃癌傳播的重要途徑，常導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，胃癌預(yù)后較差。盡管外泌體lncRNAs已被報(bào)道參與腫瘤的發(fā)展，但分泌的lncRNAs是否可以在受體細(xì)胞中編碼肽仍然未知。在這里，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)外泌體lncRNA (lncAKR1C2)，它在臨床上以不依賴于VEGF的方式與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。胃癌細(xì)胞分泌的Exo-lncAKR1C2在體內(nèi)可促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的管狀形成和遷移，促進(jìn)淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移。通過比較LN轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)病灶的代謝特點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)胃癌LN轉(zhuǎn)移灶具有較高的脂質(zhì)代謝活性。此外，外泌體lncAKR1C2在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中編碼一種微蛋白(pep-AKR1C2)，并通過調(diào)節(jié)YAP磷酸化促進(jìn)CPT1A的表達(dá)，從而增強(qiáng)脂肪酸氧化(FAO)和ATP的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了LNM的新機(jī)制，并提示外泌體lncAKR1C2編碼的微蛋白可作為晚期胃癌的治療靶點(diǎn)。本文于2023年10月發(fā)表于“Cell Death and Disease”（IF=9.0）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）外泌體lncAKR1C2與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)

        為了確定與LNM相關(guān)的外泌體lncRNA，我們?cè)谑中g(shù)前分離II/III期GC患者的血清外泌體，并進(jìn)行lncRNA-seq。通過透射電鏡觀察LNM-組和LNM+組的外泌體(圖1A)，并通過WB分析檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD9、Tsg101和Alix(圖1 B)。外泌體的大小通過納米跟蹤分析確定，這些血清外泌體的直徑約為30-150 nm(圖1C)。高通量測(cè)序結(jié)果顯示，與沒有LNM的患者相比，LNM+組的一系列外泌體lncRNAs發(fā)生了顯著變化。lncRNA ENST00000604184 (lncAKR1C2)的表達(dá)量最高(圖1D)。擴(kuò)大樣本的進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，與LNM-組相比，LNM+組的exo-lncAKR1C2表達(dá)量上調(diào)了8倍以上(圖1E)。Kaplan-Meier分析顯示，高水平的lncAKR1C2可預(yù)測(cè)較短的無進(jìn)展生存期(PFS)(圖1F)和總生存期(OS)(圖1G)。使用anti-podoplanin抗體的免疫組化分析表明，LNM患者的淋巴管密度要高得多(圖1H, 1I)，lncAKR1C2水平與淋巴管密度呈正相關(guān)(圖1 G)。盡管在胃癌合并LNM患者中VEGFC也上調(diào)(圖1K)，但VEGFC與lncAKR1C2之間沒有顯著相關(guān)性(圖1L)。這些結(jié)果表明外泌體lncAKR1C2與胃癌中LNM相關(guān)，該過程可能不依賴于VEGFC。

2）lncAKR1C2具有編碼微蛋白的潛力

        接下來，我們使用翻譯組學(xué)分析了lncAKR1C2的特征。Rio-seq的流程圖如圖2A所示。由于缺氧是實(shí)體腫瘤的共同特征之一，我們比較了低氧和常氧條件下胃癌細(xì)胞lncRNA翻譯組學(xué)的差異。缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)在缺氧處理下的MKN45細(xì)胞中顯著上調(diào)(圖2B)。除了主要的蛋白質(zhì)編碼ORF (mORF)外，還鑒定了一些來自傳統(tǒng)上被認(rèn)為不能編碼蛋白質(zhì)的RNA的小于300個(gè)核苷酸(nt)的sORF，包括來自lncRNAs的lncORF、來自mRNA上游區(qū)域的uORF和來自mRNA下游區(qū)域的dORF。不出所料，lncORF、uORF和dORF的長(zhǎng)度比mORF短得多，而lncORF的數(shù)量是mORF的6倍多(圖2C)。這些ORF的折疊變化和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)如圖2D所示，其中一組lncORF明顯增加。所有鑒定的lncORF大部分小于125 FPKM(圖2E)，肽長(zhǎng)度在30-140 aa之間(圖2I)。ORF評(píng)分和RRS評(píng)分(核糖體釋放評(píng)分)如圖2F所示。Fickett評(píng)分和Hexamer評(píng)分如圖2G所示。綜合多個(gè)評(píng)分系統(tǒng)共篩選出176個(gè) lncORFs (圖2H)。圖2J和圖2K所示為這176個(gè)lncRNA表達(dá)的熱圖主體部分。綜上，這些結(jié)果提示lncAKR1C2具有編碼微蛋白的潛力。

3）lncAKR1C2編碼微蛋白在胃癌細(xì)胞中的檢測(cè)

        根據(jù)Ribo-Seq分析，選擇了四個(gè)具有編碼短肽潛力的lncRNA進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。為了檢測(cè)lncRNA編碼肽的表達(dá)，我們構(gòu)建了包含4個(gè)lncRNA全序列的質(zhì)粒。使用抗flag抗體進(jìn)行WB分析，證實(shí)ENST00000486541和ENST00000604184 (lncAKR1C2)具有編碼短肽的能力(補(bǔ)充圖)。lncAKR1C2和AKR1C2 mRNA的預(yù)測(cè)編碼區(qū)(sORF)如圖3A所示，AKR1C2 mRNA的CDS區(qū)覆蓋了sORF的全長(zhǎng)。RNA-seq數(shù)據(jù)表明，lncAKR1C2具有編碼163-aa短微蛋白的潛力(稱為pep- AKR1C2)，因此構(gòu)建了具有突變初始密碼子(ATG→ATT)的lncAKR1C2過表達(dá)質(zhì)粒(圖3B)。野生型(sORF-Flag)和突變型lncAKR1C2 (sORF.mutt-Flag)均導(dǎo)致lncAKR1C2 RNA水平升高(圖3C)。但flag標(biāo)記的pep-AKR1C2僅在sORF-Flag組中檢測(cè)到(圖3D)。我們使用銀染色結(jié)合質(zhì)譜(MS)對(duì)pep-AKR1C2進(jìn)行分析，MS檢測(cè)到的片段氨基酸序列與Ribo-Seq預(yù)測(cè)一致(圖3E, 3F)。由于pep-AKR1C2是宿主基因(AKR1C2)的一部分，使用抗AKR1C2抗體也可以檢測(cè)到pep-AKR1C2的表達(dá)(圖3G)。最后，通過免疫熒光(IF)測(cè)定pep-AKR1C2的分布，pep-AKR1C2主要存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖3H)。綜上所述，這些結(jié)果表明lncAKR1C2在胃癌細(xì)胞中編碼163-aa微蛋白。

4）外泌體傳遞的lncAKR1C2編碼淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中的一種微蛋白

        臨床分析數(shù)據(jù)表明外泌體lncAKR1C2與淋巴管生成和LNM有關(guān)，我們接下來檢測(cè)了lncAKR1C2編碼的pep-AKR1C2在人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞(HLECS)中的表達(dá)。通過透射電鏡、NTA和WB分析觀察MKN45細(xì)胞外泌體，大多數(shù)外泌體直徑約為100 nm(圖4A-4C)。通過比較lncAKR1C2在GC細(xì)胞和HLECS中的水平，我們發(fā)現(xiàn)lncAKR1C2在GC細(xì)胞和GC外泌體中都明顯過表達(dá)(圖4D, 4E)。MKN45細(xì)胞分別過表達(dá)野生型lncAKR1C2或突變型lncAKR1C2，并收集外泌體。這些外泌體用PKH26標(biāo)記并與HLECS共培養(yǎng)，在6小時(shí)內(nèi)觀察到MKN45外泌體與HLECS融合(圖4F)，導(dǎo)致HLECS中lncAKR1C2顯著上調(diào)(圖4G)。如圖4H所示，Flag-pep-AKR1C2僅在含有野生型sORF-Flag的MKN45外泌體處理的HLECS細(xì)胞中檢測(cè)到，并且pep-AKR1C2在MKN45外泌體sORF-Flag組中增加，這表明外泌體lncAKR1C2可以在HLECS細(xì)胞中編碼微蛋白。為了提供淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中pep-AKR1C2存在的直接證據(jù)，我們用野生型lncAKR1C2、突變型lncAKR1C2或空白載體轉(zhuǎn)染HLECS。WB分析結(jié)果顯示與外泌體處理組的效果相同(圖41、4J)。此外，IF分析也表明pep-AKR1C2主要存在于HLECS細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖4K)。因此，這些數(shù)據(jù)表明GC分泌的exo-lnAKR1C2可以在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中編碼微蛋白，而pep-AKR1C2可能在細(xì)胞質(zhì)中起作用。

5）淋巴管生成需要依賴外泌體lncAKR1C2的代謝向FAO轉(zhuǎn)移

        我們通過GC足墊植入模型和代謝組學(xué)分析來確定GC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的代謝特征(圖5A, 5B)。圖5C顯示了原發(fā)性GC腫瘤(植入足墊)和LN代謝腫瘤的代謝組譜比較，LN轉(zhuǎn)移中觀察到更高水平的脂質(zhì)代謝。正如預(yù)期的那樣，用GC外泌體或lncAKR1C2處理的淋巴內(nèi)皮細(xì)胞顯示出更高的OCR和最大呼吸能力的增加(圖5D, 5E)。然而，突變的lncAKR1C2對(duì)HLECS的OCR影響很小。為了評(píng)估外泌體lncAKR1C2在脂肪酸代謝中的作用，將HLECS細(xì)胞用油酸(OA)處理24小時(shí)，然后在低糖培養(yǎng)基中再培養(yǎng)48小時(shí)，以充分利用脂肪酸。MKN45外泌體和lncAKR1C2顯著促進(jìn)了HLECS細(xì)胞對(duì)OA和ATP的利用，特別是在過表達(dá)野生型lncAKR1C2的MKN45外泌體中(圖5F, 5G)。在MKN45外泌體組中，HLECS細(xì)胞形成的環(huán)的數(shù)量和遷移細(xì)胞的數(shù)量都有所增加，并且在使用野生型lncAKR1C2過表達(dá)的MKN45外泌體處理時(shí)，數(shù)量最多。轉(zhuǎn)染lncAKR1C2也顯示出類似的效果(圖5H)。這些結(jié)果表明GC分泌的lncAKR1C2促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的形成和遷移。

6）LncAKR1C2編碼的微蛋白通過YAP途徑促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞中CPT1A的表達(dá)

        為了探索pep-AKR1C2介導(dǎo)脂肪酸代謝和淋巴管生成的潛在機(jī)制，我們采用co-IP結(jié)合LC-MS/MS對(duì)與pep-AKR1C2相互作用的蛋白進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜法檢測(cè)到的63種蛋白，其中包括Hippo通路核心蛋白之一YAP (yesassociated protein)(圖6A)。MKN45外泌體和lncAKR1C2對(duì)YAP總表達(dá)(t-YAP)影響不大，但顯著降低了磷酸化的YAP水平(p127-YAP)(圖6B)，這反過來促進(jìn)了YAP進(jìn)入細(xì)胞核(圖6C)。隨后，通過免疫熒光共定位分析也驗(yàn)證了YAP與pep-AKR1C2之間的直接相互作用(圖6D)?？紤]到近年來已有研究報(bào)道了YAP與CPT1A之間的關(guān)系，我們也檢測(cè)了CPT1A在HLECS細(xì)胞中的表達(dá)。GC分泌的外泌體lncAKR1C2顯著上調(diào)了CPT1A mRNA和蛋白水平(圖6E, 6F)。此外，lncAKR1C2對(duì)脂肪酸利用和ATP產(chǎn)生的影響被證明依賴于CPT1A(圖6G, 6H)。這些數(shù)據(jù)表明，外泌體lncAKR1C2編碼的pep-AKR1C2通過降低YAP磷酸化來促進(jìn)與FAO相關(guān)的CPT1A表達(dá)。

7）外泌體lncAKR1C2促進(jìn)體內(nèi)淋巴轉(zhuǎn)移

        為了進(jìn)一步研究外泌體lncAKR1C2對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，我們建立了腘窩淋巴轉(zhuǎn)移模型。將上述處理過的MKN45細(xì)胞植入裸鼠足墊，第40天切除腫瘤和腘窩淋巴結(jié)(圖7A)。in Vivo Imaging System顯示，lncAKR1C2過表達(dá)可顯著促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，lncAKR1C2下調(diào)可顯著抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)(圖7B,7C)。lncAKR1C2野生型組的淋巴結(jié)體積和重量也最高(圖7D,7E)。透射電鏡檢測(cè)小鼠血清外泌體，如圖7F所示。與體外實(shí)驗(yàn)一致，野生型lncAKR1C2，而非突變型lncAKR1C2，增強(qiáng)了胃癌的腫瘤發(fā)生和淋巴管生成(圖7G, 7H)。從機(jī)制上看，上調(diào)外泌體lncAKR1C2通過編碼微蛋白促進(jìn)淋巴結(jié)中CPT1A的表達(dá)(圖7I-K)。因此，這些結(jié)果提供了GC-exo-lncAKR1C2編碼微蛋白促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移的體內(nèi)證據(jù)。

8）lncAKR1C2在腫瘤發(fā)生中的體內(nèi)作用

        我們通過皮下異種移植模型研究了lncAKR1C2在體內(nèi)的作用。用慢病毒感染MKN45細(xì)胞，使其過表達(dá)野生型或突變型lncAKR1C2，或敲低lncAKR1C2，然后將這些細(xì)胞用于小鼠腫瘤植入(圖8A)。結(jié)果表明，野生型lncAKR1C2而非突變型lncAKR1C2增強(qiáng)了腫瘤生長(zhǎng)，而下調(diào)lncAKR1C2抑制了小鼠模型中的腫瘤發(fā)生(圖8B, 8C)。lncAKR1C2組的腫瘤直徑、體積和重量也更大(圖8D-8F)。在WT lncAKR1C2組中也觀察到更高水平的增殖標(biāo)志物Ki67，而lncAKR1C2的敲低導(dǎo)致Ki67水平急劇下降，突變組和對(duì)照組之間沒有顯著差異(圖8G)。最后，我們提供了一個(gè)示意圖來展示GC分泌的lncAKR1C2編碼的微蛋白在促進(jìn)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)代謝和淋巴轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用(圖8H)。

結(jié)論：

        GC來源的exo-lncAKR1C2編碼的微蛋白通過調(diào)節(jié)YAP磷酸化和CPT1A表達(dá)促進(jìn)淋巴管生成和LN轉(zhuǎn)移，這依賴于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞向脂肪酸氧化的代謝轉(zhuǎn)變。我們的研究結(jié)果為研究外泌體遞送的非編碼RNA提供了見解，并強(qiáng)調(diào)了靶向lncAKR1C2在胃癌中的診斷和治療潛力。

實(shí)驗(yàn)方法：

        外泌體分離，TEM，NTA，PKH26染色，質(zhì)譜，FA定量，ATP定量，WB，qRT-PCR，核糖體測(cè)序，RNA測(cè)序，免疫沉淀，免疫熒光，IHC，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)：

        Zhu KG, Yang J, Zhu Y, Zhu Q, Pan W, Deng S, He Y, Zuo D, Wang P, Han Y, Zhang HY. The microprotein encoded by exosomal lncAKR1C2 promotes gastric cancer lymph node metastasis by regulating fatty acid metabolism. Cell Death Dis. 2023 Oct 30;14(10):708. doi: 10.1038/s41419-023-06220-1.