口腔病原體通過(guò)促進(jìn)小鼠Th1細(xì)胞浸潤(rùn)而加重帕金森病

       帕金森病(PD)是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，致殘風(fēng)險(xiǎn)高且無(wú)法治愈。牙周炎是一種發(fā)生在牙周支持組織中的感染性細(xì)菌疾病。研究表明牙周炎與PD密切相關(guān)。然而，缺乏牙周炎對(duì)PD影響的直接證據(jù)。在本研究中，我們證明了使用齦下菌斑(LIP-SP)結(jié)扎誘導(dǎo)的牙周炎加重了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙、小膠質(zhì)細(xì)胞激活和多巴胺能神經(jīng)元丟失。16S rRNA基因測(cè)序顯示LIP?SP誘導(dǎo)口腔和腸道生態(tài)失調(diào)。特別是，在MPTP + LIP-SP處理的小鼠糞便樣本中，來(lái)自口腔結(jié)扎的小韋榮球菌(V. parvula)和變形鏈球菌(S. mutans)增加。我們進(jìn)一步證明，小韋榮球菌和變形鏈球菌在LIP-SP介導(dǎo)的PD小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙和神經(jīng)變性惡化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。小韋榮球菌和變形鏈球菌引起PD小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，腦、頸淋巴結(jié)、回腸和結(jié)腸內(nèi)Th1細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，我們觀察到IFNγ中和對(duì)小韋榮球菌和變形鏈球菌處理的PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用?？傊?，我們的研究表明口腔病原體加劇MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙和神經(jīng)退行性變。本文于2023年11月發(fā)表于“Microbiome”（IF=15.5）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）LIP-SP加重MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙和多巴胺能神經(jīng)元丟失

       為了評(píng)估牙周炎對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠運(yùn)動(dòng)功能和多巴胺能神經(jīng)元損失的影響，我們首先進(jìn)行LIP，并每周應(yīng)用三次SP誘導(dǎo)牙周炎。1個(gè)月后，我們通過(guò)腹腔注射MPTP誘導(dǎo)小鼠PD(圖1A)。行為學(xué)測(cè)試顯示，與對(duì)照組相比，MPTP顯著減少了滾軸試驗(yàn)中的潛伏時(shí)間和懸掛試驗(yàn)得分(圖1B)。LIP-SP損害了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠滾軸試驗(yàn)和懸掛試驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)功能(圖1B)。我們通過(guò)表征酪氨酸羥化酶(TH)在ST和SN中的表達(dá)來(lái)檢測(cè)LIP-SP對(duì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響。正如預(yù)期的那樣，IHC顯示MPTP處理導(dǎo)致ST中TH陽(yáng)性纖維減少近50%(圖1C-1D)，SN中TH陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元減少近50%(圖1E-1F)。重要的是，與MPTP組相比，MPTP-LIP-SP導(dǎo)致ST(圖1C-1D)和SN(圖1E-1F)中多巴胺能神經(jīng)元的顯著減少。與此觀察結(jié)果一致，western blot分析顯示MPTP誘導(dǎo)PD小鼠ST中TH蛋白水平較對(duì)照小鼠顯著降低。LIP-SP加重了MPTP處理后TH蛋白的損失(圖1G-1H)。LIP-SP對(duì)對(duì)照組小鼠的多巴胺能神經(jīng)元水平?jīng)]有顯著影響(圖1C-1H)。此外，免疫熒光分析顯示LIP-SP加速了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠SN中的小膠質(zhì)細(xì)胞活化(圖1I-1J)。單獨(dú)使用LIP和SP均不會(huì)加重MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的多巴胺能神經(jīng)元損失(補(bǔ)充圖)，提示PD的加重需要口腔病原體與牙周炎的結(jié)合。

2）LIP-SP可以改變MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的口腔和腸道微生物群

       先前的研究已經(jīng)證實(shí)了腸道生態(tài)失調(diào)在PD中的作用，我們假設(shè)LIP-SP可能通過(guò)口腸軸影響PD的發(fā)病機(jī)制。我們采用16S rRNA基因測(cè)序?qū)π∈罂谇患凹S便進(jìn)行分析。α多樣性分析顯示，MPTP組和MPTP + LIP-SP組口腔和腸道樣本中Faith的系統(tǒng)發(fā)育多樣性(Faith’s pd)有顯著差異。MPTP + LIP-SP處理的小鼠口腔和腸道微生物組的多樣性明顯高于MPTP處理的小鼠(圖2A)。β多樣性分析顯示，MPTP組和MPTP+LIP-SP組之間的口腔和腸道微生物組成存在顯著差異(圖2B)。接下來(lái)，我們使用隨機(jī)森林分析來(lái)鑒定潛在的致病菌。與MPTP處理小鼠相比，MPTP+LIP-SP處理小鼠的口腔結(jié)扎和糞便中富集了口腔病原菌小韋榮球菌和變形鏈球菌(圖2C)。接下來(lái)，我們采用qRT-PCR方法檢測(cè)了口腔結(jié)扎和糞便中小韋榮球菌和變形鏈球菌的DNA水平。與MPTP組相比，MPTP+LIP-SP組口腔結(jié)扎和糞便中小韋榮球菌和變形鏈球菌的DNA水平明顯升高(圖2D-2E)。

3）LIP-mix加重MPTP誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)功能障礙和多巴胺能神經(jīng)元丟失

       我們隨后研究了小韋榮球菌和變形鏈球菌對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD的影響。LIP-mix小鼠模型先進(jìn)行LIP，然后每周3次給藥，持續(xù)1個(gè)月，然后注射MPTP誘導(dǎo)PD(圖3A)。正如預(yù)期的那樣，通過(guò)行為測(cè)試確定，腹腔注射MPTP會(huì)損害運(yùn)動(dòng)功能。與MPTP組相比，MPTP+LIP-mix組滾軸試驗(yàn)潛伏時(shí)間縮短，懸掛試驗(yàn)評(píng)分明顯降低(圖3B)。在不腹腔注射MPTP的情況下，LIP-mix不影響運(yùn)動(dòng)功能(圖3B)。此外，LIP-mix增強(qiáng)了MPTP誘導(dǎo)的ST和SN的多巴胺能神經(jīng)元損傷。MPTP注射后，ST和SN中多巴胺能纖維和神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，LIP-mix處理導(dǎo)致MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠ST和SN中多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)一步減少(圖3C-3F)。ST中TH陽(yáng)性蛋白水平也呈現(xiàn)出類(lèi)似的趨勢(shì)(圖3G)。但對(duì)照組和LIP-mix組之間多巴胺能纖維和神經(jīng)元水平無(wú)顯著差異(圖3C-3G)。然后我們進(jìn)行了額外的實(shí)驗(yàn)，在沒(méi)有LIP誘導(dǎo)的情況下，小鼠口服小韋榮球菌和變形鏈球菌，然后用MPTP誘導(dǎo)PD(圖S4A)。我們發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有LIP的情況下，這兩種細(xì)菌幾乎不會(huì)在腸道中定植(圖S4B)，也不會(huì)加重PD(補(bǔ)充圖)。這些數(shù)據(jù)表明，小韋榮球菌和變形鏈球菌需要牙周炎的存在才能在小鼠腸道中定植，并對(duì)PD產(chǎn)生加重作用。

4）LIP-mix刺激MPTP誘導(dǎo)的小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞活化和CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)

       為了研究大腦中的神經(jīng)炎癥，我們用流式細(xì)胞術(shù)分析了腦組織樣本。與對(duì)照組相比，MPTP組小膠質(zhì)細(xì)胞(CD45low CD11b+)和CD4+T細(xì)胞(CD3+ CD4+)的數(shù)量顯著增加(圖4A, 4B)。值得注意的是，LIP-mix處理進(jìn)一步增加了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的數(shù)量(圖4A, 4B)。接下來(lái)，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢查了頸部淋巴結(jié)、回腸和結(jié)腸中的免疫細(xì)胞。與MPTP組相比，MPTP + LIP-mix組頸部淋巴結(jié)的CD4+T細(xì)胞顯著增加，但對(duì)照組與MPTP組之間沒(méi)有差異(圖4C)。同樣，LIP-mix組與MPTP組相比，MPTP+LIP-mix組的CD4+ T細(xì)胞數(shù)量增加(圖4D)。值得注意的是，MPTP組的結(jié)腸中CD4+T細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組增加。MPTP+LIP-mix組進(jìn)一步增加了這一比例(圖4E)。

5）LIP-mix促進(jìn)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠中Th1細(xì)胞的積累

       我們進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+T細(xì)胞的亞型。在腦組織中，與對(duì)照組小鼠相比，MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠中Th1細(xì)胞(CD4+ IFNγ+)增加，MPTP+LIP-mix處理的小鼠比MPTP處理的小鼠顯示更多的Th1細(xì)胞(圖5A)。然后，我們檢查了頸部淋巴結(jié)、回腸和結(jié)腸中的外周Th1細(xì)胞。在頸淋巴結(jié)和回腸中，MPTP+LIP-mix組與MPTP組相比Th1細(xì)胞明顯增加，但對(duì)照組與MPTP組之間沒(méi)有差異(圖5B, 5C)。值得注意的是，MPTP組結(jié)腸中Th1細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組增加，LIP-mix處理進(jìn)一步刺激了MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠中Th1細(xì)胞的積累(圖5D)。

6）中和IFNγ可減輕MPTP + LIP-mix處理小鼠的多巴胺能神經(jīng)元損失

       由于IFNγ是Th1細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，我們使用IFNγ中和抗體來(lái)驗(yàn)證Th1細(xì)胞是否在多巴胺能神經(jīng)元損失的加劇中起關(guān)鍵作用(圖6A)。MPTP+LIP-mix組ST中TH陽(yáng)性蛋白水平顯著降低(圖6B)。IFNγ中和并沒(méi)有阻止MPTP處理小鼠TH陽(yáng)性蛋白損失，但減輕了MPTP+LIP-mix處理小鼠TH陽(yáng)性蛋白的減少(圖6B)。同樣，IHC結(jié)果顯示LIP-mix加劇了MPTP處理小鼠ST和SN中多巴胺能纖維和神經(jīng)元的丟失(圖6C-6F)。中和IFNγ對(duì)MPTP處理的小鼠沒(méi)有影響，但減輕了MPTP+LIP-mix處理的小鼠的神經(jīng)元損失(圖6C-6F)。

結(jié)論：口腔病原體小韋榮球菌和變形鏈球菌在牙周炎的情況下加重PD的嚴(yán)重程度。從機(jī)制上講，小韋榮球菌和變形鏈球菌改變口腔和腸道微生物群，誘導(dǎo)外周和腦區(qū)Th1細(xì)胞浸潤(rùn)，從而增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，導(dǎo)致神經(jīng)退行性變。我們的研究揭示了口腔病原體加重PD的機(jī)制，為PD的預(yù)防和治療提供了新的方向。

實(shí)驗(yàn)方法：行為測(cè)試，Western blot，IHC，免疫熒光，16S?rRNA測(cè)序，qRT?PCR，流式。

參考文獻(xiàn)：Bai XB, Xu S, Zhou LJ, Meng XQ, Li YL, Chen YL, Jiang YH, Lin WZ, Chen BY, Du LJ, Tian GC, Liu Y, Duan SZ, Zhu YQ. Oral pathogens exacerbate Parkinson's disease by promoting Th1 cell infiltration in mice. Microbiome. 2023 Nov 17;11(1):254. doi: 10.1186/s40168-023-01685-w.