細(xì)胞外囊泡蛋白質(zhì)組揭示組織蛋白酶B與阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的聯(lián)系

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-08-13
致病蛋白通過(guò)細(xì)胞外囊泡(EVs)在神經(jīng)元之間傳播參與了阿爾茲海默癥進(jìn)展......

 

       阿爾茨海默病(AD)是癡呆最常見的病因,也是全球亟待解決的主要醫(yī)學(xué)問(wèn)題。該疾病的病理學(xué)特征是由淀粉樣-β肽(Aβ)在細(xì)胞外聚集構(gòu)成的淀粉樣斑塊和由磷酸化Tau蛋白(pTau)構(gòu)成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)在細(xì)胞內(nèi)沉積。近年來(lái),有人提出,致病蛋白通過(guò)細(xì)胞外囊泡(EVs)在神經(jīng)元之間傳播參與了AD進(jìn)展。外泌體、微囊泡和凋亡囊泡等EVs是含有多種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的分泌性膜囊。EVs可由多種細(xì)胞釋放,有報(bào)道稱來(lái)自CNSEVs含有aβ、其分解代謝酶和Tau等分子,這些分子均在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。該研究發(fā)表在《Brain》,IF14.5。

技術(shù)路線:

 

 

主要研究結(jié)果:

1. ATN分類中腦脊液細(xì)胞外囊泡的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

       工作流程如圖1所示。首先,利用受試者工作特征(ROC)曲線分析腦脊液aβ42、pTauTau的截?cái)嘀担?span>cut-off值)(n=60aβ42cut-off值為677.9 pg/mlAUC 0.80,靈敏度87%,特異度70%),pTaucut-off值為73.0 pg/mlAUC 0.74,靈敏度97%,特異度57%),tTaucut-off值為597.7 pg/mlAUC 0.80,靈敏度78%,特異度70%)。接下來(lái),利用這些cut-off值設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)組學(xué)分析的發(fā)現(xiàn)集(表1)。

 



       為了鑒定與AD病理進(jìn)展相關(guān)的蛋白質(zhì),研究者從16例參與者的腦脊液中分離出EVs,測(cè)量其粒徑并使用LC-MS/MS進(jìn)行分析。分離的EV平均粒徑約為120nm。從腦脊液EV中共鑒定和定量了1756個(gè)蛋白質(zhì)。鑒定的腦脊液EV蛋白質(zhì)與Vesiclepedia數(shù)據(jù)庫(kù)中top100列表中的EV蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較,在腦脊液EV蛋白質(zhì)組學(xué)列表中發(fā)現(xiàn)了top100列表中的87個(gè)蛋白質(zhì)。通過(guò)注釋、可視化和整合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析,進(jìn)一步對(duì)腦脊液EV蛋白進(jìn)行功能評(píng)估在生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分中富集的蛋白主要與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組成和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織相關(guān)。這些結(jié)果表明,樣品富含EVsA?T?N?組、A+T-N?/A+T?N+組和A+T+N+組腦脊液EVs分別鑒定出1487、15921535個(gè)蛋白質(zhì)。在所有組中檢測(cè)到約95.2%的蛋白質(zhì)(1671個(gè)蛋白質(zhì)),A?T?N?、A+T?N?/A+T?N+A+T+N+分別有1、3015個(gè)蛋白質(zhì)(圖2A)。兩組共有的蛋白質(zhì)數(shù)量為:EV標(biāo)志蛋白Alix、CD9CD63的豐度水平在三組間無(wú)差異,表明蛋白質(zhì)組學(xué)譜的差異很可能不是由于EV數(shù)量/組成的差異。

 


2 ATN分類下對(duì)發(fā)現(xiàn)集中的腦脊液細(xì)胞外囊泡(EV)蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析


2. 淀粉樣蛋白發(fā)病期間腦脊液和血漿細(xì)胞外囊泡中CatB水平升高

       CatB是在A?T?N?A+T?N?/A+T?N+之間發(fā)生顯著變化的蛋白之一,與AD腦內(nèi)的老年斑相關(guān),也參與溶酶體蛋白酶介導(dǎo)的淀粉樣前體蛋白(APP)向的加工。因此,研究者選擇了CatB,在使用CSF和血漿EVs的更大規(guī)模隊(duì)列中驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果。從136份腦脊液樣本中分離出EV,分為7個(gè)ATN組(表3),采用ELISA法測(cè)定其CatB水平(CSF-EV-CatB)。從CSF和血漿中分離出的EV平均粒徑約為105 nm。與蛋白質(zhì)組學(xué)分析一致,CSF-EV-CatB水平顯著升高(A?,35.9±24.7 pg/ml;A+95.4±23.9 pg/ml;P<0.0001)與淀粉樣蛋白陰性組相比(圖3A),并且A+T+時(shí)的水平分別顯著高于A-T-時(shí)的水平(圖3B)。CatB濃度與腦脊液aβ42濃度呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)(r=?065,P<0.0001),與pTau呈極弱相關(guān)(r=0.172,P=0.046),與tTau呈弱相關(guān)(r=0.261,P=0.019)(圖3C-E)。這些結(jié)果表明CSF-EV-CatBCSF狀態(tài)密切相關(guān)。

 


3 基于ELISA方法驗(yàn)證CatB在腦脊液細(xì)胞外囊泡中的表達(dá)


       EVs外周血中可用于監(jiān)測(cè)病變?cè)?span>CNS。因此,研究者測(cè)量總CatBEV CatB使用由ELISA血漿樣本136例(表3),由于等離子體的濃度CatB ATN組之間沒(méi)有顯著差異。與自由等離子CatB plasma-EV-CatB水平顯著增加相比,A?T?N?A?T?N?143.3±40.4 pg/ml;A+T?N?,177.7±52.6 pg/ml;P=0.042),而在其他AD連續(xù)組中沒(méi)有(圖4A)。A+組的水平顯著高于A-組,但T+/T?組和N+/N?組之間沒(méi)有差異(圖4B)。血漿-EV-CatBCSF aβ42濃度呈中度負(fù)相關(guān),但與CSF pTautau無(wú)中度負(fù)相關(guān)(圖4C-F)。這些結(jié)果提示血漿EV-CatB與腦脊液狀態(tài)相關(guān)。

 


4 ELISA驗(yàn)證血漿細(xì)胞外囊泡中的CatB作為推定的血液生物標(biāo)志物使用ATN分類

 

結(jié)論:

       總之,該研究對(duì)ATN分類中的腦脊液EVs進(jìn)行的全蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn),淀粉樣蛋白陽(yáng)性組和淀粉樣蛋白陰性組之間有6種蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變化。此外,對(duì)136份樣本的ELISA分析證實(shí),隨著淀粉樣蛋白進(jìn)展,CSF和血漿中EVs中的CatB水平升高,表明EVs中的CatB可能參與AD淀粉樣蛋白的發(fā)病機(jī)制。除了與淀粉樣蛋白病理相關(guān)的蛋白,EV蛋白質(zhì)組分析揭示了一些病理生理功能未知的蛋白,這些蛋白的表達(dá)在Tau蛋白病理/神經(jīng)變性中發(fā)生了改變,這可能有助于闡明AD的分子發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療藥物。

實(shí)驗(yàn)方法:

       質(zhì)譜分析,免疫測(cè)定,ELISA,蛋白質(zhì)組學(xué)分析

參考文獻(xiàn):

       Yuyama K, Sun H, Fujii R, Hemmi I, Ueda K, Igeta Y. Extracellular vesicle proteome unveils cathepsin B connection to Alzheimer's disease pathogenesis. Brain. 2023 Dec 10:awad361. doi: 10.1093/brain/awad361.