急性缺血誘導(dǎo)空間和轉(zhuǎn)錄上不同的小膠質(zhì)細(xì)胞亞群

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-09-11
ICAM可能引起過(guò)度神經(jīng)炎癥,加劇腦損傷......

 

         缺血性卒中后,缺血核心和梗死灶周圍區(qū)的損傷影響患者預(yù)后。微膠質(zhì)細(xì)胞立即對(duì)缺血性打擊做出反應(yīng),引發(fā)免疫炎癥,在卒中后的細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要作用。然而,微膠質(zhì)細(xì)胞的多樣性和涉及的機(jī)制仍然不清楚。我們首先對(duì)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的大鼠大腦進(jìn)行了scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST),以確定與卒中相關(guān)的微膠質(zhì)細(xì)胞亞簇及其空間分布。此外,通過(guò)RNAscope和免疫熒光技術(shù)在大鼠中驗(yàn)證了微膠質(zhì)細(xì)胞亞群特異性標(biāo)記基因的表達(dá)和不同微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的定位。進(jìn)行基因集變異分析(GSVA)以揭示微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的功能特征。此外,使用調(diào)查通路分析(IPA)來(lái)探索微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的上游調(diào)控因子,通過(guò)免疫熒光、RT-qPCR、shRNA介導(dǎo)的基因敲除和定向代謝組學(xué)進(jìn)行確認(rèn)。最后,在特定微膠質(zhì)細(xì)胞亞群操縱后,評(píng)估大鼠MCAO模型中的梗死灶大小、神經(jīng)功能缺陷和神經(jīng)元凋亡。我們?cè)?span>MCAO大鼠大腦中發(fā)現(xiàn)了與卒中相關(guān)的微膠質(zhì)細(xì)胞亞群。我們還確定了這些微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的新標(biāo)記基因,并根據(jù)它們的空間分布將這些細(xì)胞定義為缺血性核心相關(guān)(ICAM)和梗死灶相關(guān)(IPAM)的微膠質(zhì)細(xì)胞。ICAM由損傷相關(guān)分子模式誘導(dǎo),可能由糖酵解提供動(dòng)力,并表現(xiàn)出增加的促炎細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生。BACH1是驅(qū)動(dòng)ICAM生成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。相反,梗死灶中富含的糖皮質(zhì)激素可能觸發(fā)IPAM的形成,這些細(xì)胞可能由檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化提供動(dòng)力,并以中等的促炎反應(yīng)、抗炎代謝特征和髓鞘營(yíng)養(yǎng)特性為特征。ICAM可能引起過(guò)度神經(jīng)炎癥,加劇腦損傷,而IPAM可能表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)特性,對(duì)于梗死灶中細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和存活可能至關(guān)重要。我們的研究結(jié)果為以特定微膠質(zhì)細(xì)胞亞群為靶點(diǎn)的治療策略提供了生物學(xué)基礎(chǔ),成為缺血性卒中的潛在治療策略。該研究于202312月發(fā)表在《Genome medicine》,IF12.3。

技術(shù)路線:

                     

 

結(jié)果:

1、細(xì)胞類型的鑒定

         為了全面表征缺血性卒中后缺血半球主要細(xì)胞類型的變化,我們?cè)诮?jīng)歷短暫性大鼠中腦動(dòng)脈阻塞(MCAO)的大鼠的腦樣本中,采用scRNA-seq技術(shù),在再灌注后的不同時(shí)間點(diǎn)(3小時(shí)、12小時(shí)和72小時(shí))以及模擬大鼠上進(jìn)行了細(xì)胞分離(圖1A)。3小時(shí)和12小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)代表了缺血性卒中的亞急性階段,而72小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)被選為進(jìn)行急性階段變化的轉(zhuǎn)錄分析??偣苍u(píng)估了39,333個(gè)細(xì)胞,每個(gè)細(xì)胞平均含有1672-8800個(gè)獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符(UMIs),經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的CellRanger質(zhì)量控制。在四個(gè)組中,每個(gè)細(xì)胞的平均基因數(shù)為901-2636。

         接下來(lái),我們進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類,并根據(jù)經(jīng)典基因標(biāo)記表達(dá)進(jìn)行了細(xì)胞類型的注釋。如t-分布隨機(jī)鄰居嵌入(t-SNE)圖中所示,鑒定了15種不同的細(xì)胞類型,包括B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、壁細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、單核/樹(shù)突細(xì)胞(DC細(xì)胞)、成熟型寡能神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(OPC)、T細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、微膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、中性粒細(xì)胞、寡能神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和原始T細(xì)胞(圖1B)。值得注意的是,微膠質(zhì)細(xì)胞、寡能神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的大多數(shù)。我們確定了每種細(xì)胞類型的所有標(biāo)記基因,并在熱圖中顯示了前10個(gè)標(biāo)記基因(圖1C)。

         與先前的發(fā)現(xiàn)一致,缺血性打擊后浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,表明血腦屏障功能失調(diào)。此外,OPC的數(shù)量在手術(shù)后72小時(shí)顯著增加,表明中風(fēng)后OPC的增殖,這與先前的研究結(jié)果一致。我們還觀察到在缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,而在72小時(shí)時(shí)微膠質(zhì)細(xì)胞顯著減少,這可能歸因于急性缺血性損傷(圖1D)??傮w而言,這些數(shù)據(jù)提供了對(duì)缺血半球細(xì)胞組成的基本描述。

 

 

2、缺血誘導(dǎo)兩種類型的小膠質(zhì)細(xì)胞亞簇

         考慮到微膠質(zhì)細(xì)胞在大腦中的重要性和微膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的高質(zhì)量,我們將焦點(diǎn)放在了單細(xì)胞水平的微膠質(zhì)細(xì)胞上。我們?cè)诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)確定了微膠質(zhì)細(xì)胞的差異表達(dá)基因(DEGs)。與先前的研究結(jié)果一致,微膠質(zhì)細(xì)胞DEGsKEGG分析表明,在缺血性卒中的急性階段,微膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬和炎癥能力增強(qiáng),代謝發(fā)生改變。此外,微膠質(zhì)細(xì)胞被分為四個(gè)亞群進(jìn)行進(jìn)一步的分析(圖2A)。根據(jù)亞群比例圖,模擬組中94%的微膠質(zhì)細(xì)胞屬于亞群2。此外,微膠質(zhì)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)基因(Tmem119、P2ry12P2ry13、Csf1r、Cx3cr1、Hexb)在亞群2中高度表達(dá),表明亞群2可能由穩(wěn)態(tài)微膠質(zhì)細(xì)胞組成。亞群4465個(gè)細(xì)胞)包括相對(duì)較少數(shù)量的微膠質(zhì)細(xì)胞,在模擬和MCAO大鼠之間變化不大;因此,亞群4的表型和功能特征未進(jìn)一步研究。亞群1和亞群3占據(jù)了MCAO組中微膠質(zhì)細(xì)胞的大多數(shù)。這些發(fā)現(xiàn)將亞群1和亞群3定位為缺血性卒中急性階段的關(guān)鍵角色,并提出了它們?nèi)绾螀f(xié)調(diào)缺血性攻擊適應(yīng)的問(wèn)題。

         進(jìn)行差異基因表達(dá)分析以識(shí)別亞群特異性標(biāo)記基因。大多數(shù)高表達(dá)的基因也是亞群特異性的,表明微膠質(zhì)細(xì)胞亞群具有獨(dú)特的基因表達(dá)模式(圖2B)。亞群1表達(dá)了先前未報(bào)道的標(biāo)記基因(例如,Pik3ip1、Cd300lf、Gpr65、Ms4a6c、Cep152Ddit4、Zbtb16Abhd15、BmfArhgap24)。在亞群3中,Lgals3、Plau、Srxn1Ankrd33b、Gas2l3、Nes、Edn1Fam129b、Vat1Fmn1的表達(dá)上調(diào)。前10個(gè)亞群特異性標(biāo)記基因可可靠地識(shí)別微膠質(zhì)細(xì)胞亞群1和亞群3。此外,疾病相關(guān)微膠質(zhì)細(xì)胞(DAM)曾被確定為與阿爾茨海默?。?span>AD)相關(guān)的一種獨(dú)特的微膠質(zhì)細(xì)胞亞型。我們檢查了我們數(shù)據(jù)集中已確定的DAM標(biāo)記基因的表達(dá)水平。在四個(gè)亞群中,一些基因(例如Tyrobp、Trem2Apoe、Timp2B2m)的表達(dá)保持不變。在亞群3中,一些基因的表達(dá)上調(diào),例如Lgal3、Fth1、Cstb、Csf1、Cd63、Cd9、Ccl3Lilrb4a,而與穩(wěn)態(tài)微膠質(zhì)細(xì)胞(亞群2)相比,亞群1中這些基因的表達(dá)保持不變,表明亞群3可能表現(xiàn)出DAM樣的特征。

         為了確定亞群1和亞群3是否具有時(shí)間特性,我們使用RNAscopeACDNewark,CA,USA)進(jìn)行了RNA-蛋白共染色,使用亞群1特異性標(biāo)記基因Gpr65和亞群3特異性標(biāo)記基因Srxn1標(biāo)記不同的微膠質(zhì)細(xì)胞群體(圖2C)。在再灌注后,亞群1和亞群3均作為對(duì)缺血性打擊的迅速反應(yīng)者(圖2D)。為了確認(rèn)亞群1和亞群3是否也存在于其他關(guān)于缺血性卒中的單細(xì)胞RNA測(cè)序研究數(shù)據(jù)中,我們重新分析了幾個(gè)現(xiàn)有的缺血性卒中后微膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)據(jù)集(GSE174574,GSE197731,GSE227651)。與我們的結(jié)果一致,亞群1和亞群3在它們的t-SNE微膠質(zhì)細(xì)胞圖中可以清晰地區(qū)分出來(lái)。

         為了確定亞群1和亞群3是否與梗死核心存在任何空間關(guān)系,我們使用了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)(ST)來(lái)研究模擬和MCAO大鼠的腦切片。盡管ST幾乎無(wú)法達(dá)到單細(xì)胞分辨率,但仍然可以通過(guò)計(jì)算與scRNA-seq數(shù)據(jù)相關(guān)的亞群特異性標(biāo)記基因的平均表達(dá)來(lái)獲得腦切片中不同細(xì)胞亞群的大致位置。為了定義缺血性核心,我們還查詢了在腦切片上每個(gè)點(diǎn)的下調(diào)表明神經(jīng)元喪失的神經(jīng)元基因。引人注目的是,亞群3標(biāo)記基因占據(jù)了缺血性核心,而亞群1標(biāo)記基因則環(huán)繞著缺血病灶在缺血后12小時(shí)(圖2E)。因此,我們將亞群1定義為缺血性梗死后的微膠質(zhì)細(xì)胞(IPAM),將亞群3定義為缺血性梗死核心相關(guān)的微膠質(zhì)細(xì)胞(ICAM)。

         為了驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn),我們?cè)诿庖邿晒鈱?shí)驗(yàn)中使用ICAM特異性的LGALS3作為ICAM標(biāo)記,而選擇PIK3IP1作為IPAM標(biāo)記。在12小時(shí)和72小時(shí)時(shí),ICAM標(biāo)記在缺血性核心中顯著富集。IPAM標(biāo)記在12小時(shí)時(shí)在缺血性梗死灶周圍的位置也得到了確認(rèn)。此外,ICAM特異性標(biāo)記(Lgals3)和IPAM特異性標(biāo)記(Pik3ip1、Gpr65Ms4a6c)也在ST中可視化顯示。我們還根據(jù)圖2E將腦切片分為兩個(gè)區(qū)域(缺血性核心和梗死周圍區(qū))。在缺血性核心中上調(diào)的基因被定義為缺血性核心基因(ICGs),而在梗死周圍上調(diào)的基因被稱為缺血性梗死周圍基因(IPGs)。與ICGs重疊的ICAM標(biāo)記更多,與IPGs重疊的IPAM標(biāo)記也更多,進(jìn)一步驗(yàn)證了ICAMIPAM的空間分布。因此,我們的數(shù)據(jù)揭示了兩個(gè)在缺血性卒中應(yīng)答中涉及的在空間上和轉(zhuǎn)錄上具有不同特性的微膠質(zhì)細(xì)胞亞群。


 

3、ICAM IPAM 表現(xiàn)出截然不同的特征

         對(duì)于功能實(shí)驗(yàn),我們對(duì)IPAMICAM進(jìn)行了基因集變異分析(GSVA)(圖3A)。我們發(fā)現(xiàn)ICAM可能在代謝上更依賴于糖酵解,而IPAM可能依賴于三羧酸循環(huán)(TCA)和氧化磷酸化(OXPHOS),通過(guò)使用Seurat中的AddModuleScore 計(jì)算與感興趣的代謝途徑相關(guān)的基因的表達(dá)來(lái)證實(shí)(圖3A、B)。一致地,氧化磷酸化檸檬酸循環(huán)IPG中也富集,如KEGG分析所示。ICAM斷裂TCA循環(huán)也可能導(dǎo)致中間產(chǎn)物水平的增加,如ICAM中增強(qiáng)的泛酮酸和輔酶A生物合成所示。此外,在IPAM中觀察到AMPKcAMP信號(hào)通路的上調(diào),表明IPAM使用了完全不同的能源來(lái)源(圖3A)。此外,微膠質(zhì)細(xì)胞的代謝重編程依賴于HIF-1α通路,ICAMHIF-1α通路也高度表達(dá)(圖3A)。

         我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)相對(duì)于其他亞群,ICAM中存在一些促炎和炎癥響應(yīng)基因(Il1a、Il1b、Il6、Il18、Tnf、Hmox1、Ptgs2)的表達(dá)上調(diào)(圖3C)。此外,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在MCAO12小時(shí)開(kāi)始浸潤(rùn)大腦,并在72小時(shí)時(shí)聚集在梗死核心,這表明這些外周免疫細(xì)胞在空間上與ICAM存在重疊。由于微膠質(zhì)細(xì)胞是缺血性卒中中各種趨化因子的主要來(lái)源,我們檢查了ICAMIPAM中驅(qū)動(dòng)不同外周免疫細(xì)胞招募的一系列趨化因子的表達(dá)。因此,ICAM中富集了不同外周免疫細(xì)胞中相關(guān)趨化因子基因集的表達(dá)(圖3D)。具體而言,與IPAM相比,ICAMCcl2、Ccl3Ccl4、Ccl5Cxcl2Cxcl16的表達(dá)水平更高。此外,KEGG分析一致表明,促炎信號(hào)通路(“TNF信號(hào)通路、“IL-17信號(hào)通路、“MAPK信號(hào)通路)在ICG中顯著富集。這些發(fā)現(xiàn)表明由ICAM介導(dǎo)的過(guò)度促炎和趨化反應(yīng),提示ICAM可能在缺血性卒中急性階段加速組織損傷,具有不利影響。

         此外,與ICAM相比,GSVA分析顯示,IPAM中與氨基酸、脂質(zhì)和碳水化合物相關(guān)的幾個(gè)代謝途徑顯著富集(圖3A)。支鏈氨基酸(BCAAs)如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的水平在ICAM中升高,而在IPAMBCAAs降解被增強(qiáng)(圖3E)。此外,IPAM中其他氨基酸的代謝,如?;撬?,也富集(圖3A)。根據(jù)GSVA數(shù)據(jù),脂質(zhì)代謝在IPAM中也很活躍,包括鞘脂代謝、主要膽酸生物合成、不飽和脂肪酸生物合成、脂肪酸降解和延長(zhǎng),通過(guò)AddModuleScore確認(rèn)(圖3A,3E)。此外,IPAM中富集的代謝途徑(“BCAAs降解不飽和脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、脂肪酸延長(zhǎng)、鞘脂代謝)在ST中也顯示了一個(gè)梗死周圍的分布。

         由于脂質(zhì)代謝產(chǎn)物是髓鞘的重要組成部分,IPAM可能通過(guò)供應(yīng)脂質(zhì)組分來(lái)補(bǔ)償寡突細(xì)胞。此外,我們使用CellPhoneDB 分析了IPAM-寡突細(xì)胞相互作用中的配體-受體相互作用。已經(jīng)確定了幾對(duì)配體-受體對(duì),其中GRN-SORT1是其中最顯著的一對(duì)。為了測(cè)試GRN是否具有寡突細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的潛力,我們用重組小鼠GRNrmGRN)處理寡突細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)rmGRN顯著促進(jìn)了MAG的表達(dá)。

         總的來(lái)說(shuō),這些獨(dú)特的特征至少在一定程度上塑造了微膠質(zhì)細(xì)胞的應(yīng)答,并為理解微膠質(zhì)細(xì)胞亞群在對(duì)缺血刺激的響應(yīng)中不同的激活狀態(tài)提供了新的視角。

 

 

4M1/M2 二分法無(wú)法對(duì)缺血后的小膠質(zhì)細(xì)胞亞簇進(jìn)行分類

         在歷史上,基于體外刺激,微膠質(zhì)細(xì)胞曾經(jīng)簡(jiǎn)單地被分類為促炎性的“M1”和抗炎性的“M2”。然而,根據(jù)我們的數(shù)據(jù),M1極化評(píng)分的增加總是伴隨著不同時(shí)間點(diǎn)上升的M2極化評(píng)分(圖4A)。我們想知道我們的無(wú)監(jiān)督聚類是否與這種表型分類相對(duì)應(yīng)。為了測(cè)試這個(gè)假設(shè),我們分別在IPAMICAM上執(zhí)行了M1/M2極化評(píng)分。然而,ICAMM1M2極化評(píng)分都高于IPAM(圖4B-D)。此外,IPAMICAM在缺血損傷后的不同時(shí)間點(diǎn)上展現(xiàn)出相同的M1/M2極化改變趨勢(shì)(圖4E-F)。

         接下來(lái),我們還進(jìn)行了偽時(shí)軌跡分析,并觀察到在缺血后出現(xiàn)了明顯的分歧軌跡。為了闡明這兩個(gè)分支是否與M1-M2-表型微膠質(zhì)細(xì)胞一致,我們檢查了不同軌跡中M1/M2標(biāo)記基因的表達(dá)。在這兩個(gè)分支之間,M1/M2標(biāo)記基因的表達(dá)仍然沒(méi)有顯著差異(圖4G)。基于許多關(guān)于M1/2微膠質(zhì)細(xì)胞的已發(fā)表的體內(nèi)研究,我們注意到研究人員使用Iba-1,這不僅在微膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),而且在巨噬細(xì)胞中也表達(dá),作為微膠質(zhì)標(biāo)記。他們還使用CD86CD16(由Fcgr4編碼)標(biāo)記“M1”微膠質(zhì)細(xì)胞,使用Arg1CD206(由Mrc1編碼)標(biāo)記“M2”微膠質(zhì)細(xì)胞。然而,根據(jù)我們的scRNA-seq數(shù)據(jù),“M1”微膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(Cd86Fcgr4)在微膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均有表達(dá),而“M2”微膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(Arg1Mrc1)主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá),表明滲透的巨噬細(xì)胞可能被錯(cuò)誤地認(rèn)定為經(jīng)典定義的“M2”微膠質(zhì)細(xì)胞(圖4H)。因此,M1/M2的二分法可能無(wú)法識(shí)別不同的微膠質(zhì)細(xì)胞亞群,并描繪它們?cè)谌毖蟮墓δ堋?/span>


 

5、關(guān)鍵 DAMP 和調(diào)節(jié)子驅(qū)動(dòng) ICAM 生成

         我們假設(shè)區(qū)域微環(huán)境信號(hào)可能驅(qū)動(dòng)微膠質(zhì)細(xì)胞代謝和功能的轉(zhuǎn)變,使其朝著ICAMIPAM方向發(fā)展。通過(guò)使用Ingenuity System Pathway AnalysisIPA)軟件(QIAGEN),我們發(fā)現(xiàn)脂多糖(LPS)是推動(dòng)ICAM生成的最重要的潛在因素之一(圖5A)。由于LPSTLR4激活的經(jīng)典配體,我們調(diào)查了在腦缺血后釋放的TLR4內(nèi)源性配體HMGB1的空間分布。在MCAO后的12小時(shí)內(nèi),在梗死核內(nèi)受損神經(jīng)元內(nèi)明顯出現(xiàn)HMGB1的胞質(zhì)轉(zhuǎn)位,這表明HMGB1,作為一種被廣泛認(rèn)識(shí)的損傷相關(guān)分子模式(DAMP),在梗死核釋放并可能驅(qū)動(dòng)ICAM的形成(圖5B)。我們發(fā)現(xiàn)在LPS刺激后,大多數(shù)ICAM特異性標(biāo)記基因在初級(jí)微膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào),而IPAM標(biāo)志基因的表達(dá)變化較?。▓D5C,D)。為了調(diào)查垂死神經(jīng)元釋放的DAMP是否誘導(dǎo)ICAM的生成,我們還通過(guò)多次凍融小鼠神經(jīng)細(xì)胞系HT-22制備了神經(jīng)源性的DAMP,如先前描述的 。結(jié)果表明,處理HT-22DAMP的初級(jí)微膠質(zhì)細(xì)胞顯著上調(diào)了ICAM標(biāo)記基因,而IPAM標(biāo)記沒(méi)有顯著差異。

         除了細(xì)胞外的微環(huán)境信號(hào)外,我們還研究了哪些細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子驅(qū)動(dòng)ICAM的生成。使用單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類(SCENIC)分析 來(lái)闡明缺血性卒中后微膠質(zhì)細(xì)胞亞群形成的關(guān)鍵分子機(jī)制。通過(guò)全面考慮調(diào)控子活性評(píng)分(RAS)和調(diào)控子特異性評(píng)分(RSS),我們確定FOSL1BACH1是最強(qiáng)大的ICAM特異性轉(zhuǎn)錄因子(TFs)之一(圖5E,F)。研究表明,在ST中,Fosl1在急性缺血后在缺血區(qū)域上調(diào)和富集。此外,BACH1下游靶基因的富集分析(使用Metascape)發(fā)現(xiàn)它們與炎癥顯著相關(guān)(例如,“細(xì)胞遷移的正調(diào)控”,“MAPK級(jí)聯(lián)的正調(diào)控“TNF-α NF-κB信號(hào)通路,細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控“MyD88無(wú)依賴TLR4級(jí)聯(lián),“IL-17信號(hào)通路,對(duì)氧化應(yīng)激的應(yīng)答模式識(shí)別受體信號(hào)通路),這與ICAM的促炎作用一致。為了驗(yàn)證BACH1對(duì)ICAM的調(diào)控能力,我們轉(zhuǎn)染了攜帶靶向Bach1的短發(fā)夾RNAshRNA)的慢病毒的BV2細(xì)胞。Bach1-knockdownLPS刺激后下調(diào)了ICAM特異性標(biāo)記基因(Edn1,Plau)的表達(dá)水平,表明BACH1有潛力將穩(wěn)態(tài)微膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為ICAM。此外,LPS刺激后,經(jīng)典的促炎因子,包括Tnf,Il1a,Il6Il1b,在Bach1-knockdown細(xì)胞中也下調(diào)了(圖5G-J)。


 

6、糖皮質(zhì)激素觸發(fā) IPAM 形成

         為了識(shí)別IPAM的關(guān)鍵上游調(diào)控因子,使用了前200個(gè)IPAM標(biāo)記基因進(jìn)行IPA。令人驚訝的是,地塞米松(DEX)是誘導(dǎo)IPAM最強(qiáng)大的刺激因素(圖6A)。為了探索中風(fēng)后糖皮質(zhì)激素濃度的變化,我們進(jìn)一步利用高通量靶向代謝組學(xué)來(lái)篩選在缺血后顯示變化的類固醇。根據(jù)定量數(shù)據(jù),皮質(zhì)酮和11-去氧皮質(zhì)酮的水平在MCAO后在缺血核心和梗死周圍區(qū)域均顯著增加(圖6B)。為了驗(yàn)證,我們使用DEX刺激初級(jí)微膠質(zhì)細(xì)胞,強(qiáng)烈誘導(dǎo)了IPAM的生成,并顯著增強(qiáng)了IPAM特異性標(biāo)記基因的表達(dá)(圖6C)。此外,小鼠主要的腎上腺皮質(zhì)類固醇皮質(zhì)酮也顯著上調(diào)了初級(jí)微膠質(zhì)細(xì)胞中IPAM特異性標(biāo)記基因的表達(dá),表明糖皮質(zhì)激素具有推動(dòng)IPAM生成的強(qiáng)大能力(圖6D)。

         為了在小鼠中驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn),對(duì)MCAO小鼠進(jìn)行了皮質(zhì)酮或糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑(RU486)的處理。令人驚訝的是,接受皮質(zhì)酮處理的MCAO小鼠顯示出相對(duì)較輕的神經(jīng)功能缺陷(圖6E-I)和減少的神經(jīng)元凋亡(圖6J,K)。然而,在小鼠中RU486的投與導(dǎo)致更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺陷(圖6E-I)和加劇的神經(jīng)元死亡(圖6J,K)。

         為了在不同實(shí)驗(yàn)組中研究IPAM的變化,我們采用了免疫染色并測(cè)量了微膠質(zhì)細(xì)胞中PIK3IP1的表達(dá)。與對(duì)照組相比,PIK3IP1的平均熒光強(qiáng)度在皮質(zhì)酮處理組中顯著更高,而在RU486處理組中相對(duì)較低(圖6L,M)。因此,這些體外和體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證了糖皮質(zhì)激素在推動(dòng)IPAM生成以及在缺血性卒中的急性階段中IPAM的神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)中的決定性作用。

 

 

實(shí)驗(yàn)方法:

         慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、梗塞體積測(cè)量、神經(jīng)行為測(cè)試、t-SNE 降維、scRNA-seq、GSVA、偽時(shí)間分析、軌跡推斷、SCENIC、TUNEL染色、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、實(shí)時(shí)定量 PCR、Western blot、RNAscope、靶向代謝組學(xué)。

參考文獻(xiàn):

         Li, H., Liu, P., Zhang, B. et al. Acute ischemia induces spatially and transcriptionally distinct microglial subclusters. Genome Med 15, 109 (2023).