METTL16的乳酸化通過FDX1 mRNA的m6A修飾促進(jìn)銅死亡

         m6A是RNA的一種表觀遺傳修飾，將這種化學(xué)標(biāo)記添加到RNA分子中，通過影響RNA分子的命運(yùn)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這種轉(zhuǎn)錄后RNA修飾是可逆的，由甲基轉(zhuǎn)移酶“writers”和去甲基化酶“erasers”調(diào)節(jié)。m6A修飾的RNA的命運(yùn)取決于識(shí)別和結(jié)合它們的不同“readers”的功能。由于m6A甲基化修飾在調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展中的重要作用。下圖為2023年m6A修飾的中標(biāo)項(xiàng)目：

         胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。幽門螺桿菌感染、過量攝入鹽和硝酸鹽以及其他環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素對(duì)胃癌的發(fā)生有很大影響。此外，遺傳改變和宿主因素也與GC的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。盡管手術(shù)和輔助治療方法有所改善，但晚期GC患者的預(yù)后仍然較差，5年生存率<25%。更好地了解這種致命疾病的潛在機(jī)制并制定更有效的靶向治療策略對(duì)于改善胃食癌患者的臨床結(jié)果是必要的。該文章于2023年10月發(fā)表在《nature communication》，IF：16.6

技術(shù)路線： 

研究結(jié)果：

1.胃癌中銅含量過高，與腫瘤進(jìn)展有關(guān)

         銅死亡是由銅濃度過高引起的，但腫瘤中銅死亡的調(diào)控機(jī)制仍有待探索。由于銅主要通過胃和小腸上部吸收，胃腸道腫瘤適合研究銅增生的發(fā)生和發(fā)展。我們分析了48對(duì)胃癌組織和鄰近組織中的銅濃度，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的銅濃度高于正常胃組織(圖1A, P < 0.01)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，III期胃癌患者的相對(duì)銅含量高于I期和II期胃癌患者(圖1B, P < 0.05)，表明銅含量與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。此外，銅含量與GC患者的總生存期(OS)和無病生存期(DFS)呈負(fù)相關(guān)(圖1C, d;log-rank P < 0.05)。同時(shí)，銅含量與細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)(圖1E)。同樣，銅含量與患者血清標(biāo)本中血小板/淋巴細(xì)胞比率和中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率呈正相關(guān)，這兩者都是GC浸潤(rùn)性惡性腫瘤炎癥相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志物(圖1F, G)。這些結(jié)果表明，高銅含量參與了GC的進(jìn)展和發(fā)展。此外，我們還檢測(cè)了不同GC類型中銅濃度的差異，特別是在惡性腫瘤類型中。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)粘液腺癌中的銅濃度高于整個(gè)胃腫瘤(圖1H)。在粘液腺癌中，銅含量與浸潤(rùn)性指標(biāo)如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(圖1I)和血管浸潤(rùn)(圖1J)呈正相關(guān)。黏液性腺癌是一種罕見的組織學(xué)亞型，與非黏液性腺癌相比，黏液性腺癌的分期更晚期，5年OS和DFS更差。粘液腺癌是一種難治性胃癌，具有放化療耐藥的特點(diǎn)，迫切需要更有效的治療方法。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)，高細(xì)胞內(nèi)銅濃度觸發(fā)還原酶FDX1將Cu2+還原為毒性更強(qiáng)的Cu+形式，導(dǎo)致銅死亡。我們發(fā)現(xiàn)，與正常胃組織相比，GC中的FDX1蛋白水平更高(圖1K)。由于GC中FDX1蛋白水平和銅含量較高，可能更容易引發(fā)銅沉積。它為胃癌提供了一種潛在的治療策略，特別是對(duì)惡性腫瘤-粘液腺癌。

圖1. 胃癌中銅含量過高，與腫瘤進(jìn)展有關(guān)

2.METTL16是銅死亡的關(guān)鍵介質(zhì)

         有報(bào)道稱，與良性胃病和健康對(duì)照患者相比，胃癌組的總m6A水平顯著升高，并促進(jìn)胃癌發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)、轉(zhuǎn)移甚至多藥耐藥的過程。然而，m6A修飾與銅突的關(guān)系仍不清楚。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)銅含量與GC組織中總m6A水平呈正相關(guān)(R = 0.5116)(圖2A)。此外，銅顯著上調(diào)GC細(xì)胞中m6 A修飾的總水平(圖2B)?？紤]到甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(METTL)家族在促進(jìn)m6A修飾中起主導(dǎo)作用，我們分析了以1:1比例使用埃司氯莫爾/雙硫拉姆和銅處理METTL敲低細(xì)胞的活力。結(jié)果表明，METTL16敲低導(dǎo)致對(duì)埃司克洛莫爾/雙硫侖-銅處理產(chǎn)生耐藥性(圖2C-E)。此外，四硫鉬酸鹽(TTM)是一種銅體變形抑制劑，在對(duì)照細(xì)胞和METTL16敲低的細(xì)胞中抑制了銅體變形，表明METTL16參與了銅體變形(圖2F)。觀察到的結(jié)果與METTL16敲除克隆細(xì)胞系相似(圖2G, H)。這些結(jié)果表明，METTL16在銅增生中起著至關(guān)重要的作用。

圖2. METTL16是銅死亡的關(guān)鍵介質(zhì)

3.METTL16通過靶向FDX1促進(jìn)銅死亡

         METTL16在許多轉(zhuǎn)錄中負(fù)責(zé)m6 A的沉積。因此，在穩(wěn)定的穩(wěn)敲對(duì)照和穩(wěn)敲METTL16細(xì)胞系中進(jìn)行甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)測(cè)序(圖3A)。。使用HOMER軟件預(yù)測(cè)每個(gè)樣品中潛在的m6 A修飾，m6 A修飾主要映射到經(jīng)典的GGAC基序(圖3B)。GO富集分析顯示，mettl16修飾基因富集了前15條通路，其中一些與線粒體通路相關(guān)(圖3C)。此外，我們從銅質(zhì)增生相關(guān)通路中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)與METTL16穩(wěn)敲組中m6A甲基化水平低以及mRNA水平下調(diào)相關(guān)的典型因子(圖3D。qPCR分析顯示，METTL16穩(wěn)敲細(xì)胞中FDX1、MTF1、PDHB、ATP7A和DLD mRNA水平降低。與對(duì)照細(xì)胞相比，F(xiàn)DX1在METTL16-sh細(xì)胞中的mRNA水平下降最為顯著(圖3E)。此外，在METTL16- sh或-KO細(xì)胞中檢測(cè)到FDX1蛋白水平顯著降低(圖3F, G)?？紤]到FDX1是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，我們推測(cè)METTL16誘導(dǎo)的銅細(xì)胞凋亡依賴于FDX1。接下來，我們?cè)u(píng)估METTL16是否通過影響FDX1的表達(dá)來調(diào)節(jié)銅死亡。鑒于蛋白質(zhì)脂酰化是銅氧化的關(guān)鍵因素，我們使用硫辛酸特異性抗體作為DLAT脂?；臏y(cè)量，評(píng)估了METTL16敲低是否會(huì)影響蛋白質(zhì)脂?；＝Y(jié)果顯示，METTL16敲低導(dǎo)致DLAT脂酰化降低，通過免疫印跡檢測(cè)(圖3H)。此外，在 METTL16-Sh 或 -KO 細(xì)胞中檢測(cè)到 FDX1 蛋白水平顯著降低 (3F,G)?？紤]到FDX1是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，我們推測(cè)METTL16通過FDX1誘導(dǎo)銅死亡。

圖3. METTL16通過靶向FDX1促進(jìn)銅死亡

4.METTL16通過 FDX1 mRNA的m6A修飾促進(jìn) FDX1 的積累

         為了進(jìn)一步探討METTL16如何調(diào)控m6 A修飾從而影響FDX1 mRNA水平，我們進(jìn)行了基因特異性MeRIP-qPCR分析。我們發(fā)現(xiàn)，在METTL16敲除和敲除細(xì)胞中，F(xiàn)DX1 mRNA上的m6 A水平顯著降低在轉(zhuǎn)染mettl16過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中顯著增加(圖4A, B)。當(dāng)使用放線菌素D (ActD)停止轉(zhuǎn)錄時(shí)，mettl16敲除細(xì)胞中FDX1 mRNA的衰減速度比對(duì)照細(xì)胞快(圖4C)。。這些結(jié)果表明mettl16介導(dǎo)的甲基化導(dǎo)致FDX1 mRNA的穩(wěn)定性。整合基因組學(xué)觀察(IGV)分析FDX1富集的m6 A峰顯示，與對(duì)照細(xì)胞(紅色峰)相比，METTL16-sh細(xì)胞(綠色峰)中的m6 A水平降低，表明METTL16可能促進(jìn)FDX1在CDS或3'UTR區(qū)域的m6 A修飾(圖4D)。因此，我們將FDX1的部分CDS融合到pGL3熒光素酶報(bào)告基因下游，構(gòu)建FDX1- wt熒光素酶報(bào)告基因。通過共轉(zhuǎn)染FDX1熒光素酶報(bào)告基因和不同劑量的METTL16- oe質(zhì)粒，我們發(fā)現(xiàn)METTL16顯著提高了FDX1熒光素酶的活性(圖4E)。

         為了進(jìn)一步探索它，我們使用SRAMP(基于序列的m6A修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)器)預(yù)測(cè)了FDX1 mRNA上可能的m6A修飾位點(diǎn)。綜合圖4e的預(yù)測(cè)結(jié)果和數(shù)據(jù)，我們以非常高的置信度確定了兩個(gè)潛在的m6 A修飾位點(diǎn):FDX1轉(zhuǎn)錄本的CDS區(qū)域602a位點(diǎn)和UTR區(qū)域820 A位點(diǎn)(圖4F, G)。隨后使用特異性引物進(jìn)行MeRIP-qPCR分析，證明FDX1轉(zhuǎn)錄本上的602位點(diǎn)是mettl16介導(dǎo)的甲基化的直接底物(圖4H)。此外，我們基于FDX1-WT熒光素酶報(bào)告基因，用胸腺嘧啶(T)取代m6A基序中的特異性腺苷(A)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了FDX1-602-Mut和FDX1-820-Mut熒光素酶報(bào)告基因(圖4H)。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果表明，METTL16不能促進(jìn)602位點(diǎn)突變的FDX1-CDS/UTR報(bào)告基因構(gòu)建體的熒光素酶活性(圖4I)。對(duì)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中METTL16和FDX1的表達(dá)分析表明，METTL16和FDX1在GC中呈正相關(guān)(圖4j)。此外，免疫組織化學(xué)染色顯示，在包含54對(duì)GC和鄰近正常組織的組織芯片中，METTL16的表達(dá)與FDX1的表達(dá)呈正相關(guān)(圖4K)。綜上所述，這些結(jié)果證實(shí)了mettl16介導(dǎo)的FDX1 mRNA上的m6 A修飾對(duì)FDX1 mRNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

圖4.  METTL16通過 FDX1 mRNA的m6A修飾促進(jìn) FDX1 的積累

5.METTL16在銅脅迫下在 K229 位點(diǎn)乳酸化

         接下來，我們?cè)u(píng)估了METTL16是否對(duì)GC中的銅脅迫有反應(yīng)。銅處理后，METTL16 mRNA和蛋白水平不變，但FDX1蛋白水平顯著升高(圖5A, B)。為了驗(yàn)證銅脅迫下FDX1表達(dá)上調(diào)是否依賴于METTL16，我們測(cè)量了在存在或不存在銅的情況下，METTL16敲除或敲除細(xì)胞中FDX1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，METTL16缺乏消除了銅誘導(dǎo)的FDX1上調(diào)(圖5C, D)。由于METTL16 mRNA和蛋白水平在銅脅迫下保持不變，我們隨后使用質(zhì)譜法測(cè)量了METTL16 PTM的變化。分析顯示，METTL16蛋白序列上有11個(gè)乳酸化位點(diǎn)和2個(gè)乙酰化位點(diǎn)(圖5E)。乳酸處理后，6個(gè)乳酸化位點(diǎn)(紅色)的PTM水平顯著升高，提示這6個(gè)位點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞中可能受到調(diào)控。然后我們證實(shí)了對(duì)銅脅迫的乳酸化或乙酰化反應(yīng)的存在。結(jié)果顯示，銅處理顯著提高了METTL16的乳酸化水平，而不是乙?；?圖5F)。為了確定METTL16在銅相關(guān)代謝中的重要乳酸化位點(diǎn)，我們生成了這6個(gè)乳酸化位點(diǎn)的乳酸化缺陷突變體(K ~ R)和K410(作為代表位點(diǎn)，其乳酸化在乳酸脅迫下保持不變)。我們發(fā)現(xiàn)只有METTL16-K229R突變體在銅脅迫下顯示乳酸化減少(圖5G)。隨后，通過LC-MS/MS分析得到METTL16-K229與其他乳酸化位點(diǎn)的b-y離子匹配圖(圖5H)。為了進(jìn)一步證實(shí)銅脅迫下METTL16-K229的乳酸化，我們生成了一種METTL16乳酸-K229抗體，并利用乳酸-K229肽和表達(dá)METTL16- wt、-K229R或-K229E的細(xì)胞來驗(yàn)證其有效性和特異性(圖5I, J)。銅和乳酸處理均誘導(dǎo)K229發(fā)生強(qiáng)烈的METTL16乳酸化(圖5k, l)，表明K229是銅相關(guān)代謝中必需的乳酸化位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，銅脅迫下METTL16在K229位點(diǎn)發(fā)生乳酸化。在穩(wěn)定的METTL16拯救(METTL16-WT、-K229R或-K229E)細(xì)胞系中，內(nèi)源性METTL16被野生型(WT)、乳酸化缺陷(K229R)或乳酸化模擬(K229E)取代，進(jìn)一步確保了FDX1蛋白水平。結(jié)果顯示，mettl16敲除細(xì)胞中FDX1蛋白水平下降，在METTL16-WT或-K229E拯救細(xì)胞后恢復(fù)，但METTL16-K229R拯救細(xì)胞中沒有恢復(fù)(圖5M)。綜上所述，銅脅迫誘導(dǎo)了METTL16- k229的乳酸化，并促進(jìn)了METTL16的甲基轉(zhuǎn)移酶活性。

圖5.  METTL16在銅脅迫下在 K229 位點(diǎn)乳酸化

6.SIRT2 使 METTL16-K229 脫乳酸并抑制METTL16活性

         SIRT2被鑒定為METTL16的結(jié)合蛋白，是一種典型的去乙?；?，分為主要的去乙?；负腿樗徂D(zhuǎn)移酶組(圖6A)。EIF3b也被鑒定為METTL16的結(jié)合蛋白，與以往的研究一致29。為了研究和驗(yàn)證METTL16和SIRT2之間的相互作用，在HGC-27細(xì)胞中檢測(cè)到METTL16-SIRT2結(jié)合(圖6B)。使用His-pull-down試驗(yàn)驗(yàn)證了METTL16-SIRT2的直接關(guān)聯(lián)(圖6C)。METTL16-K229的乳酸化被SIRT2過表達(dá)顯著抑制(圖6D)，并被SIRT2敲低或用SIRT2抑制劑- AGK2處理促進(jìn)(圖6E)。

         此外，銅誘導(dǎo)的METTL16-K229的乳酸化被SIRT2過表達(dá)抑制，而被SIRT2敲低或AGK2處理增加(圖6F, G)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明SIRT2與K229位點(diǎn)的METTL16相互作用并使其去乙?；?。我們進(jìn)一步探討了SIRT2在穩(wěn)定的METTL16拯救(METTL16- wt， -K229R或-K229E)細(xì)胞系中對(duì)METTL16的調(diào)控作用。SIRT2過表達(dá)抑制了METTL16- wt細(xì)胞中的FDX1 m6 A水平，但在METTL16- k229r或-K229E細(xì)胞中沒有，這表明SIRT2通過METTL16- k229的乳酸化抑制了METTL16的活性(圖6H, I)。此外，SIRT2過表達(dá)抑制了FDX1蛋白水平(圖6J)，而SIRT2敲低和AGK2處理促進(jìn)了FDX1蛋白水平(圖6K)。免疫熒光染色(IF)結(jié)果顯示，GC組織芯片中SIRT2蛋白水平與FDX1蛋白水平呈負(fù)相關(guān)(圖6l)。

圖6. SIRT2 使 METTL16-K229 脫乳酸并抑制METTL16活性

7.SIRT2-METTL16-FDX1-銅死亡軸支持一種有前途的治療策略

         FDX1是銅質(zhì)增生的重要介質(zhì)，銅質(zhì)增生是一種潛在的癌癥治療方法53。我們發(fā)現(xiàn)，在sirt2抑制或銅誘導(dǎo)的METTL16-K229乳酸化后，F(xiàn)DX1蛋白水平升高。接下來，我們研究了METTL16-K229乳酸化對(duì)銅生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示，銅脅迫下METTL16敲低介導(dǎo)的DLAT脂酰化降低在METTL16- wt /-K229E細(xì)胞中得以恢復(fù)，但在METTL16- k229r細(xì)胞中沒有恢復(fù)(圖7A)。此外，在銅存在的情況下，elesclool處理在METTL16-WT或-K229E細(xì)胞中誘導(dǎo)銅變性，但在METTL16-K229R細(xì)胞中沒有(圖7B)。此外，SIRT2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了銅脅迫下METTL16-WT誘導(dǎo)的DLAT脂?；脑黾樱珱]有逆轉(zhuǎn)METT16-K229E誘導(dǎo)的DLAT脂酰化，這表明SIRT2通過使METTL16K229去乙酰化來抑制cupropsis(圖7C)。與此一致的是，AGK2處理促進(jìn)了METTL16-WT細(xì)胞中的DLAT脂?；?，而在銅脅迫下的METTL16-K229R細(xì)胞中則沒有(圖7D)。此外，在埃司克洛莫爾和銅存在的情況下，AGK2治療促進(jìn)銅增生(圖7E)。我們進(jìn)一步評(píng)估了METTL16乳酸化是否能增強(qiáng)接受埃司洛莫爾治療的小鼠異種移植腫瘤的治療反應(yīng)。將METTL16-WT、-K229R、-K229E細(xì)胞皮下注射到裸鼠左右后腿上方。METTL16-WT組和-K229E組小鼠腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，而METTL16-K229R組則沒有，通過腫瘤體積和重量的減少可以觀察到(圖7F-H)。腫瘤切片F(xiàn)DX1染色在METTL16-WT和-K229E組中高于METTL16-K229R組(圖7I)。這些結(jié)果表明，K229位點(diǎn)METTL16的乳酸化狀態(tài)在銅質(zhì)增生的決定中起著至關(guān)重要的作用。此外，在異種腫瘤移植中使用埃司克洛莫爾和AGK2聯(lián)合治療。腫瘤切片分析顯示，AGK2在體內(nèi)對(duì)埃司氯莫爾治療增敏，通過腫瘤體積和重量的減少可以觀察到(圖7J - L)。這些結(jié)果表明，埃雷斯洛莫爾和AGK2聯(lián)合治療胃癌，特別是惡性腫瘤-粘液腺癌(高銅含量)是有希望的治療方法。

圖7.SIRT2-METTL16-FDX1-銅死亡軸支持一種有前途的治療策略

結(jié)論：

         在這里，我們證明了研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)銅離子促進(jìn)了胃癌的整體m6A修飾，其中METTL16介導(dǎo)的FDX1 mRNA - m6A在促進(jìn)銅死亡方面起到關(guān)鍵作用。具體而言，銅離子通過調(diào)控乳?；负腿ト轷；窼IRT2 調(diào)控METTL16-K229乳?；瑥亩{(diào)控其活性。乳酰化的METTL16引起FDX1-602位點(diǎn)發(fā)生甲基化修飾，促進(jìn)FDX1表達(dá)，導(dǎo)致銅死亡發(fā)生。SIRT2是一種典型的去乙酰化酶，其抑制劑AGK2在該途徑中可以顯著促進(jìn)METTL16的乳酰化及FDX1的m6A修飾，促進(jìn)銅死亡。因此，AGK2聯(lián)合銅死亡誘導(dǎo)劑伊利司莫（Eles），可以促進(jìn)惡性胃癌的治療。

實(shí)驗(yàn)方法：

         WB、q-RTPCR、異種移植瘤實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建、m6斑點(diǎn)印跡測(cè)定、熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、His-pull-down測(cè)定、IP、免疫熒光、MeRIP-qPCR、甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序、RIP、體外乳酸化測(cè)定

參考文獻(xiàn)：

         Sun L, Zhang Y, Yang B, et al. Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 2023;14(1):6523. Published 2023 Oct 20.