TREM2巨噬細(xì)胞通過SLC25A53重編程代謝促進(jìn)心肌梗死心臟修復(fù)

         心肌梗死（Myculal Infarction，MI）是常見的一種死亡原因，盡管可通過血運(yùn)重建和藥物進(jìn)行治療，但MI的死亡率并沒有顯著下降，對(duì)人類健康造成了嚴(yán)重威脅。MI的修復(fù)過程中需要單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的及時(shí)參與以清除死亡的心肌細(xì)胞，并保持局部心肌中促炎和抗炎因子之間的平衡。髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2（Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 2，TREM2）參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞反應(yīng)，包括胞葬、細(xì)胞存活和炎癥。以往的研究主要集中在TREM2參與慢性疾病，而其在急性疾?。ㄈ缧募」Ｋ溃┲械淖饔蒙胁磺宄?。本研究旨在探討TREM2在心肌梗死中的作用，并闡明其在心臟修復(fù)過程中的功能。具體而言，作者觀察到TREM2影響巨噬細(xì)胞胞葬糖代謝和抗炎途徑，且TREM2在巨噬細(xì)胞中的過度表達(dá)可以改善心肌梗死后心臟功能的惡化，這是一種有希望的MI治療方法?？傊狙芯拷沂玖司奘杉?xì)胞特異性TREM2在心肌梗死中的新作用，將胞葬與心臟修復(fù)過程中的免疫代謝聯(lián)系起來。

         該研究于2024年1月5日發(fā)表在《Cell Death & Differentiation》，IF：12.4

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1. TREM2+巨噬細(xì)胞參與MI早期階段

         作者已確認(rèn)了表達(dá)TREM2的主要細(xì)胞類型是巨噬細(xì)胞。接下來為了闡明TREM2在MI中的作用，首先檢測(cè)了心肌梗死后（post-MI）心臟中TREM2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TREM2的表達(dá)水平顯著高于假心梗組，提示TREM2的表達(dá)與缺血激發(fā)的反應(yīng)有關(guān)（圖1A-C）。值得注意的是，post-MI TREM2的表達(dá)表現(xiàn)出時(shí)間模式。post-MI第1天，TREM2的表達(dá)水平開始增加，第3天顯著升高，第7天達(dá)到峰值，最終恢復(fù)到基線（圖1A-C）。進(jìn)一步研究MI不同區(qū)域的TREM2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它主要表達(dá)在MI邊緣區(qū)和缺血區(qū)（圖1A-C）。.此外，大多數(shù)TREM2+細(xì)胞為CD68+巨噬細(xì)胞，而不是Ly6G+中性粒細(xì)胞（圖1E-G）?？紤]到TREM2+中性粒細(xì)胞浸潤缺血性心臟組織的轉(zhuǎn)運(yùn)募集，且TREM2+巨噬細(xì)胞在post-MI修復(fù)過程中存在時(shí)間較長，作者決定將研究重點(diǎn)放在MI中的TREM2+巨噬細(xì)胞上。

         在WT小鼠中post-MI TREM2+巨噬細(xì)胞主要是CCR2+MHCIIlow細(xì)胞（圖1H，I為第3天和第7天），表明TREM2+巨噬細(xì)胞傾向于表現(xiàn)出抗炎表型。此外，對(duì)從MI患者獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中TREM2的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MI患者的TREM2的水平升高，且在3-5天觀察到水平最高的。重要的是，這種TREM2表達(dá)的增加并不歸因于循環(huán)單核細(xì)胞數(shù)量的增加，根據(jù)人類單核細(xì)胞CD14正常表達(dá)后（圖1J）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)。提示MI患者PBMC中TREM2表達(dá)的升高可能是由于TREM2表達(dá)的誘導(dǎo)，而不是單核細(xì)胞群體的變化。

圖1：TREM2主要在免疫組織中表達(dá)，MI應(yīng)激誘導(dǎo)TREM2表達(dá)

2. 巨噬細(xì)胞特異性TREM2缺失加重MI損傷

         為了研究TREM2+巨噬細(xì)胞對(duì)MI的特異性影響，通過LysMCre小鼠與TREM2flox/flox小鼠雜交條件性敲除巨噬細(xì)胞中TREM2，并與對(duì)照小鼠（TREM2flox/flox）進(jìn)行了比較。巨噬細(xì)胞中TREM2敲除后導(dǎo)致心功能顯著下降，如EF和FS減少，以及LVED和LVESV等與post-MI對(duì)照組相比增加（圖2A，B）。此外，Masson三色染色顯示整個(gè)心臟的一系列切片纖維化減少，以及Mac-TREM2 KO組梗死區(qū)左心室壁厚度顯著減少（圖2C，D）。接下來，作者對(duì)post-MI心臟的死細(xì)胞清除、血管生成和纖維化產(chǎn)生進(jìn)行了組織學(xué)評(píng)估。與對(duì)照組相比，Mac-TREM2 KO小鼠的ACs（凋亡心肌細(xì)胞）顯著增加（圖2E，G）。此外，纖維化標(biāo)志物，如Vimentin、α-SMA以及增殖標(biāo)志物Ki67的免疫熒光染色顯示Mac-TREM2 KO組纖維化產(chǎn)生較少（圖2F，H，I）。這些發(fā)現(xiàn)表明Mac-TREM2 KO小鼠壞死細(xì)胞清除受損，纖維化產(chǎn)生減少。然而，兩組之間的血管生成沒有觀察到顯著差異（圖2J）。

         此外，對(duì)巨噬細(xì)胞亞群進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)MI組TREM2敲除小鼠在梗死后7天表現(xiàn)出MHCIIlow巨噬細(xì)胞水平顯著降低（圖2K，L）。這些發(fā)現(xiàn)表明TREM2可能調(diào)節(jié)post-MI巨噬細(xì)胞的功能和極化。為了進(jìn)一步確認(rèn)在MI中發(fā)揮主要作用的巨噬細(xì)胞來源，用CCR2趨化因子受體拮抗劑RS504393阻斷了循環(huán)單核細(xì)胞的招募，這不影響常駐巨噬細(xì)胞群體。有趣的是，CCR2抑制劑導(dǎo)致對(duì)照組EF減少和梗死面積增加，但它不影響Mac-TREM2 KO小鼠的post-MI心臟功能（圖2M，N）。這表明在MI中發(fā)揮作用的是招募的CCR2+TREM2+巨噬細(xì)胞。

圖2：巨噬細(xì)胞中TREM2的條件敲除對(duì)MI小鼠心臟的影響

3. 巨噬細(xì)胞中TREM2缺失抑制胞葬

         通過生物信息學(xué)分析（GSE98563）觀察到TREM2巨噬細(xì)胞主要與增強(qiáng)的吞噬作用相關(guān)（圖3A）。此外，吞噬細(xì)胞和溶酶體相關(guān)基因的表達(dá)在TREM2 KO巨噬細(xì)胞中明顯較低，但在過表達(dá)TREM2的巨噬細(xì)胞中較高（圖3B-D）。為了評(píng)估TREM2+巨噬細(xì)胞在缺血性心臟病中的胞葬能力，Tdtomato+或ZsGreen+小鼠LAD結(jié)扎后從缺血心臟獲得的Td+或Zs+標(biāo)記的ACs與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。體內(nèi)，Td+或Zs+標(biāo)記的ACs注射到對(duì)照組和Mac-TREM2 KO小鼠的腹腔和心肌中。體外，過表達(dá)TREM2的RAW264.7細(xì)胞孵育Td+ACs。正如預(yù)期的那樣，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都支持了TREM2促進(jìn)巨噬細(xì)胞胞葬的假設(shè)（圖3E-H）。我們進(jìn)一步評(píng)估了心臟內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬心肌細(xì)胞的能力。Ter119+CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少，普魯士藍(lán)染色減少，進(jìn)一步證實(shí)post-MI第7天Trem2缺失與巨噬細(xì)胞吞噬功能缺陷相關(guān)。

圖3：TREM2缺失減弱巨噬細(xì)胞的胞葬能力

4. TREM2+巨噬細(xì)胞通過胞葬調(diào)控SYK-SMAD4信號(hào)通路抑制SLC25A53表達(dá)

         為了深入了解TREM2如何影響巨噬細(xì)胞功能的潛在機(jī)制，對(duì)CCR2cre-EGFP和CCR2cre-EGFP TREM2flox/flox小鼠post-MI第7天的CCR2+細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq。發(fā)現(xiàn)在MI發(fā)生中，TREM2 KO巨噬細(xì)胞經(jīng)歷了幾個(gè)與吞噬相關(guān)過程、碳水化合物代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序改變（圖4A）。此外，SLC25A53被鑒定為TREM2 KO巨噬細(xì)胞體外（GSE98563）的差異表達(dá)基因，SLC家族與胞葬和體內(nèi)代謝相關(guān)（圖4B）。SLC程序在胞葬后被激活，這表明代謝程序發(fā)生了轉(zhuǎn)變，在這種轉(zhuǎn)變中改變的代謝物可以影響微環(huán)境中的大量細(xì)胞。在TREM2 KO BMDM中，ACs刺激下SLC25A53表達(dá)增加，而在吞噬抑制劑細(xì)胞松弛素D處理后減少，這表明巨噬細(xì)胞中TREM2影響SLC25A53的表達(dá)（圖4C，D）。為了探索TREM2如何調(diào)節(jié)SLC25A53，用KnockTF篩選潛在的調(diào)節(jié)因子。結(jié)果表明SMAD4是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子（圖4E），TREM2可能通過激活SYK促進(jìn)SMAD4的表達(dá)。在對(duì)照組和TREM2 KO細(xì)胞間驗(yàn)證這一假設(shè)（圖4F）。使用SYK抑制劑或SMAD4抑制劑能夠挽救表型，證明SYK-SMAD4-SLC25A53信號(hào)通路（圖4G）。綜上得出結(jié)論，TREM2在胞葬后通過SYK-SMAD4抑制SLC25A53的表達(dá)。

圖4：胞葬后TREM2+巨噬細(xì)胞通過SYK-SMAD4-SLC25A53途徑下調(diào)SLC25A53表達(dá)

5. TREM2+巨噬細(xì)胞通過胞葬后影響線粒體SLC25A53轉(zhuǎn)運(yùn)NAD+

         已有研究結(jié)果促使作者進(jìn)一步研究SLC25A53的功能。該基因有一個(gè)能將NAD+導(dǎo)入線粒體哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)體中的重要同源物SLC25A51。因此，作者懷疑SLC25A53也可以轉(zhuǎn)運(yùn)NAD+。為了探索這一假設(shè)，首先采用AutoDock Vina模擬SLC25A53和NAD+之間的分子對(duì)接，結(jié)合能為-8 kcal/mol，表明二者具有很強(qiáng)的真正結(jié)合潛力（圖5A）。接下來評(píng)估了SLC25A53體外轉(zhuǎn)運(yùn)NAD+的能力。TREM2 KO中，線粒體NAD+水平顯著增加，但細(xì)胞松弛素D處理后這種增加消失了（圖5B）。此外，轉(zhuǎn)染si-SLC25A53后，TREM2 KO線粒體中NAD+水平升高受到抑制（圖5C）。在不添加NAD+的情況下，si-SLC25A53組線粒體NAD+水平幾乎與NAD+合成抑制劑FK866處理組相當(dāng)，而外源性NAD+并沒有增加si-SLC25A53中線粒體NAD+的含量（圖5D）。這表明在TREM2+巨噬細(xì)胞中線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)NAD+時(shí)SLC25A53起了作用，但對(duì)NAD+的整體細(xì)胞水平?jīng)]有影響。

6. TREM2通過SLC25A53促進(jìn)巨噬細(xì)胞中衣康酸生成

         研究表明，胞葬后發(fā)生代謝重編程，胞葬的代謝副產(chǎn)物可以影響周圍的細(xì)胞。post-MI Mac-TREM2 KO中ACs減少和纖維化增加，為了調(diào)查TREM2+巨噬細(xì)胞是否分泌影響缺血微環(huán)境內(nèi)心肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的產(chǎn)物。作者先使用壞死心肌細(xì)胞的上清液來刺激對(duì)照和Mac-TREM2 KO BMDMs，然后收集這些BMDMs的條件上清來刺激缺血和缺氧心肌細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞。值得注意的是，來自TREM2 KO巨噬細(xì)胞的上清液處理時(shí)觀察到心肌細(xì)胞凋亡的增加和成纖維細(xì)胞增殖的減少（圖5E，F(xiàn)）。根據(jù)已有的研究結(jié)果和文獻(xiàn)，提出了一個(gè)新假設(shè)，即TREM2+巨噬細(xì)胞通過胞葬后下調(diào)SLC25A53的表達(dá)，從而影響糖代謝，其代謝副產(chǎn)物可能對(duì)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生影響。

         為了驗(yàn)證猜想并尋找可能的代謝物，作者將凋亡的H9C2細(xì)胞與BMDM一起孵育，然后對(duì)分離的線粒體進(jìn)行LC-MS代謝譜分析。觀察到TREM2 KO BMDM中TCA循環(huán)代謝物的水平較高（圖5G），在分析的代謝物中，衣康酸是最顯著的代謝物（圖5H）。比較衣康酸衍生物4-OI和衣康酸對(duì)缺血和缺氧條件下心肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的影響。結(jié)果表明4-OI和衣康酸處理組均表現(xiàn)出較高的成纖維細(xì)胞增殖（圖5I）和較低的細(xì)胞凋亡。衣康酸來源于巨噬細(xì)胞中TCA循環(huán)中的順烏頭酸，這種有機(jī)酸被認(rèn)為是代謝過程中異檸檬酸（ICIT）轉(zhuǎn)化為氧戊二酸（AKG）時(shí)潛在斷點(diǎn)的結(jié)果。此外，干擾NAD+運(yùn)輸進(jìn)入線粒體后TCA循環(huán)中斷，這種干擾與導(dǎo)致衣康酸產(chǎn)生的斷點(diǎn)相吻合。這表明TREM2+巨噬細(xì)胞中的SLC25A53下調(diào)通過非活性NAD+運(yùn)輸中斷TCA循環(huán)導(dǎo)致衣康酸上調(diào)（圖5J）。

圖5：TREM2+巨噬細(xì)胞通過SLC25A53影響線粒體NAD+的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而促進(jìn)衣康酸釋放

7. 注射TREM2腺病毒后改善左心室重構(gòu)

         小鼠LAD結(jié)扎后立即向心肌注射TREM2（Ad-TREM2）腺病毒和對(duì)照（Ad-NC）腺病毒來進(jìn)行挽救實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證TREM2在體內(nèi)的效果。接受Ad-TREM2治療的小鼠在post-MI第7天的EF顯著提高（圖6A）。此外，Ad-TREM2組表現(xiàn)出更好的LV重塑（圖6B、C），TREM2表達(dá)較高，SLC25A53表達(dá)較低（圖6D）。此外，研究顯示心臟中近80%的Ad-TREM2（GFP+TREM2+）細(xì)胞是CD64+巨噬細(xì)胞（圖6E）。此外，Ad-TREM2小鼠中分離的心臟巨噬細(xì)胞中SLC25A53表達(dá)水平較低，NAD+含量降低（圖6F，G）。這些結(jié)果證實(shí)了TREM2過表達(dá)下調(diào)巨噬細(xì)胞中的SLC25A53，并改善心肌梗死后心臟的功能和結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步研究了衣康酸對(duì)心肌梗死后心臟損傷的作用。結(jié)果表明，4-OI注射導(dǎo)致EF顯著恢復(fù)（圖6H）。Masson染色顯示4-OI給藥的小鼠壁厚增加（圖6I，J）。這些結(jié)果提示衣康酸衍生物對(duì)心肌梗死的潛在治療作用。.

圖6：體內(nèi)注射TREM2-過表達(dá)腺病毒后改善左心室重構(gòu)

結(jié)論

         本研究表明心肌梗死中巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)TREM2，使用RNA-seq、蛋白質(zhì)和分子對(duì)接以及靶向代謝組學(xué)（LC-MS），發(fā)現(xiàn)表達(dá)TREM2的巨噬細(xì)胞在胞葬后通過SYK-SMAD4信號(hào)通路抑制SLC25A53轉(zhuǎn)錄，損害NAD+運(yùn)輸?shù)骄€粒體功能，SLC25A53下調(diào)導(dǎo)致三羧酸循環(huán)中出現(xiàn)斷點(diǎn)，隨后增加衣康酸的產(chǎn)生。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TREM2+巨噬細(xì)胞分泌的衣康酸抑制心肌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。相反，在巨噬細(xì)胞中過度表達(dá)TREM2可以改善心臟功能。機(jī)制圖如下所示?？傊?，本研究為TREM2巨噬細(xì)胞在心肌梗死中的作用提供了新的見解，并揭示了潛在的機(jī)制，為增強(qiáng)損傷后心臟修復(fù)開辟了新的可能性。

實(shí)驗(yàn)方法

         小鼠心肌梗死模型及超聲心動(dòng)圖，免疫熒光染色和激光共聚焦熒光顯微鏡分析，組織學(xué)，蛋白提取及蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)，定量聚合酶鏈反應(yīng)PCR，流式細(xì)胞術(shù)，心臟內(nèi)注射腺病毒，骨髓來源巨噬細(xì)胞的生成，原代心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，從hiPSCs分化心肌細(xì)胞，原代心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的測(cè)定，外分泌體外試驗(yàn)，衣康酸刺激，體內(nèi)和體外的胞葬實(shí)驗(yàn)，NAD/NADH+檢測(cè)，粒體NAD+攝取測(cè)定，RNA測(cè)序，LC-MS分析

參考文獻(xiàn)

         Gong Shiyu, Zhai Ming, Shi Jiayun, et al. TREM2 macrophage promotes cardiac repair in myocardial infarction by reprogramming metabolism via SLC25A53.[J] .Cell Death Differ, 2024, undefined: undefined.