AURKAIP1通過穩(wěn)定三陰性乳腺癌中DDX5推動腫瘤進展

       極光-A 激酶互作蛋白 1（AURKAIP1）作為極光-A 激酶的負調(diào)控因子，已被證明在癌癥中起著中間作用。然而，AURKAIP1本身是否以及如何直接參與調(diào)控惡性腫瘤仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，AURKAIP1在三陰性乳腺癌（TNBC）中明確上調(diào)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期和預(yù)后不良呈正相關(guān)。沉默AURKAIP1可明顯抑制TNBC細胞在體外和體內(nèi)的增殖和遷移。機制上，AURKAIP1通過阻止泛素化和降解直接與 DEAD-box螺旋酶5（DDX5）蛋白相互作用并使其穩(wěn)定。AURKAIP1沉默以DDX5依賴的方式抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性。該研究于2023年12月發(fā)表在《Cell Death & Disease》，IF：9.0。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. AURKAIP1在TNBC中上調(diào)，并與不利的臨床結(jié)果相關(guān)

       利用多個GEO數(shù)據(jù)集（GSE38959、GSE45827和GSE65194）篩選TNBC組織與正常乳腺樣本之間的差異表達基因（DEGs），得到TNBC樣本與正常組織相比的3835個DEGs（|log2FC|>1且FDR<0.05）（圖1A）。為進一步縮小DEGs 的范圍，對TCGA-BRCA 數(shù)據(jù)集中的3835個DEGs 進行Kaplan-Meier生存分析，篩選出16 個候選基因（圖 1B）?？偨Y(jié)目前的分析結(jié)果和文獻報道，最終確定探討AURKAIP1在 TNBC 腫瘤進展中的作用。對TCGA-BRCA數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示，與未配對的正常乳腺組織和非TNBC樣本相比，AURKAIP1在TNBC樣本中明顯上調(diào)（圖1C）。同時，通過評估不同AURKAIP1表達之間的生存概率，驚人地發(fā)現(xiàn)AURKAIP1的高表達與TNBC患者而非非TNBC患者較差的OS和RFS相關(guān)，這充分證明AURKAIP1可能是TNBC特異性的預(yù)后生物標志物（圖1D）。為進一步證實這些發(fā)現(xiàn)，研究人員通過IHC對10名SYSUCC TNBC患者的癌組織和相匹配的鄰近非癌組織進行檢測，驗證AURKAIP1的高表達（圖1E）。隨后，研究人員利用含有100個TNBC樣本的組織芯片（TMA）驗證了AURKAIP1的表達與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腫瘤分級、T期、N期和TNM分期的關(guān)系（圖1F）。結(jié)果顯示，AURKAIP1高表達的TNBC患者往往腫瘤較大、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多且臨床分期較重。此外，多變量Cox回歸分析表明，AURKAIP1 和N分期一樣，可能是 TNBC 的獨立預(yù)后指標（圖 1G）。此外，從Kaplan-Meier生存分析來看，AURKAIP1水平較高的TNBC患者的OS概率往往較低（圖1H），這重申AURKAIP1是TNBC的一個不利特征。

圖1. 在三陰性乳腺癌（TNBC）中觀察到 AURKAIP1 表達上調(diào)，這與 TNBC 患者預(yù)后較差有關(guān)

2. AURKAIP1 表達的改變會影響 TNBC 細胞在體外和體內(nèi)的增殖和遷移

       通過qRT-PCR和Western印跡測定AURKAIP1在不同細胞系中的mRNA和蛋白水平，結(jié)果表明，與正常乳腺細胞系MCF 10A相比，AURKAIP1在TNBC細胞中的表達量明顯更高（圖2A）。在 MDA-MB-231 和 BT 549 細胞系中敲除或過表達 AURKAIP1（圖 2B）。CCK8增殖實驗（圖2D）和克隆形成實驗（圖2C）表明，基于siRNA的AURKAIP1敲除大大抑制TNBC細胞的增殖能力，而過表達AURKAIP1則完全增強TNBC細胞的增殖能力。重要的是，這些體外實驗結(jié)果在體內(nèi)的異種移植實驗中得到進一步證實（圖 2E）。進行跨孔實驗（圖 3A、B）和傷口愈合實驗（圖 3C）以評估 AURKAIP1 是否影響 TNBC 細胞遷移。結(jié)果表明，AURKAIP1沉默會異常降低細胞遷移能力，而AURKAIP1過表達則顯示出相反的效果。綜上所述，AURKAIP1失活會損害體外和體內(nèi)TNBC細胞的增殖和遷移。

圖2. AURKAIP1 促進三陰性乳腺癌的細胞增殖和遷移

圖3. AURKAIP1 對 TNBC 的細胞遷移有促進作用

3. AURKAIP1 以 DDX5 介導(dǎo)的模式促進 TNBC 的發(fā)展

       采用了共免疫沉淀（CoIP）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS）的方法來研究與AURKAIP1相互作用的蛋白。在剔除用 IgG 進行陰性對照的數(shù)據(jù)后，合并 MDA-MB-231 和 BT 549 細胞的 CoIP-MS 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) 63 個蛋白與 AURKAIP1 有相互作用（圖 4A）。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn) DDX5 在包括乳腺癌在內(nèi)的腫瘤中具有明確的作用機制，因此將 DDX5 確定為互作靶點，并進一步研究 AURKAIP1 是否通過 DDX5 媒介促進 TNBC 的發(fā)展。不出所料，在 MDA-MB-231 和 BT 549 細胞中進行的進一步 CoIP 試驗支持 DDX5 與AURKAIP1 直接結(jié)合（圖 4B）。此外，雙重免疫熒光染色也顯示AURKAIP1 蛋白與 DDX5 蛋白的共定位（圖 4C）。綜上所述，目前的實驗證據(jù)表明 DDX5 和 AURKAIP1 直接相互作用。隨后研究AURKAIP1 對 DDX5 的具體調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，減少 AURKAIP1 能明顯降低 DDX5 蛋白水平（圖 4E），而 mRNA 水平?jīng)]有明顯變化（圖 4D）。相應(yīng)地，過表達 AURKAIP1 同樣增加DDX5 蛋白水平的表達，而不是 mRNA 標準。細胞免疫熒光再次證實這一觀察結(jié)果（圖 4F），闡明AURKAIP1 可能通過翻譯后方式參與 DDX5 調(diào)節(jié)的內(nèi)在機制。

       鑒于AURKAIP1與DDX5之間存在調(diào)控關(guān)系，因此值得研究AURKAIP1是否通過DDX5對TNBC腫瘤發(fā)揮抗癌作用。qRT-PCR和Western blot實驗均表明，在MDA-MB-231細胞中單純過表達DDX5并不能改變AURKAIP1的表達，這為DDX5作為AURKAIP1的下游分子提供了線索（圖4G，H）。更令人信服的是，在 AURKAIP1 敲除細胞中過量表達 DDX5 可以逆轉(zhuǎn)沉默 AURKAIP1 在 CCK8（圖 4I）和跨孔遷移試驗（圖 4J）中產(chǎn)生的致癌表型。因此，AURKAIP1在TNBC發(fā)育過程中的功能確實是由DDX5介導(dǎo)的。

圖4. AURKAIP1與DDX5直接相互作用，并通過DDX5的介導(dǎo)促進TNBC的進展

4. AURKAIP1 的沉默有助于 DDX5 的泛素降解

       由于 AURKAIP1 對 DDX5 的影響僅停留在蛋白質(zhì)水平，根據(jù)上述結(jié)果推測 AURKAIP1 可能通過降解來調(diào)節(jié) DDX5 蛋白質(zhì)。為驗證這一推測，使用 CHX（50 ug/ml）阻斷蛋白質(zhì)的合成，并檢測到在 AURKAIP1 敲除的 MDA-MB-231 和 BT 549 細胞中 DDX5 的半衰期縮短了圖 5A）。耐人尋味的是，蛋白酶體抑制劑 MG132 恢復(fù)AURKAIP1 沉默引起的 DDX5 蛋白豐度下降（圖 5B）。研究進一步表明，AURKAIP1 維持DDX5 蛋白的穩(wěn)定性，從而緩解其降解。

       盡管 DDX5 的翻譯后修飾包括泛素化、磷酸化以及總和化，但上述結(jié)果表明 AURKAIP1 通過泛素化影響DDX5 的蛋白水解。為進一步證實這一點，在轉(zhuǎn)染AURKAIP1 shRNA 或 Flag-AURKAIP1 質(zhì)粒的 HEK 293T 細胞中同時轉(zhuǎn)染MYC-Ub 和 HA-DDX5 質(zhì)粒。DDX5 泛素的檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 AURKAIP1 siRNA 后，HA-DDX5 泛素化的程度明顯高于空白對照（圖 5C）。同時，轉(zhuǎn)染 Flag-AURKAIP1時，HA-DDX5泛素化相對減少。綜上所述，這些結(jié)果表明AURKAIP1可抑制DDX5泛素化，從而減少其蛋白酶體降解。

圖5. AURKAIP1 通過阻止DDX5的泛素降解來穩(wěn)定DDX5

5. AURKAIP1 通過靶向 DDX5 觸發(fā) Wnt/β-catenin 信號通路

       對源數(shù)據(jù)集（GSE38959、GSE45827 和 GSE65194）進行基因組富集分析（GSEA），以揭示 AURKAIP1 功能所涉及的信號通路（圖 6A）。結(jié)果顯示，AURKAIP1 的功能與 Wnt/β-catenin 信號通路密切相關(guān)（圖6B）。此外，AURKAIP1與Wnt/β-catenin信號通路的表達數(shù)據(jù)在TCGA-TNBC中顯示出明顯的正相關(guān)（圖6C）。根據(jù)這些研究證據(jù)推測AURKAIP1在TNBC中是通過DDX5介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控發(fā)揮作用的。首先，TOP/FOP-閃爍熒光素酶實驗也顯示沉默AURKAIP1可以明顯抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)（圖6D）。為證實AURKAIP1確實對Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有影響，WB分析檢測β-catenin、CyclinD1、c-Myc和Met的蛋白水平（圖6E）。不出所料，敲除 AURKAIP1 后，β-catenin 及其靶基因的蛋白水平同時受到抑制，而過表達 AURKAIP1 后，β-catenin 及其靶基因的蛋白水平同樣升高。此外，細胞免疫熒光也可觀察到β-catenin蛋白的變化（圖 6F）。CCK8和Transwell遷移實驗再次反映出AURKAIP1確實通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路對TNBC有積極作用（圖6G，H）。

       過表達 DDX5 明顯改善AURKAIP1 沉默導(dǎo)致的 TOP/FOP-flash 熒光素酶活性的降低（圖 6I）。同樣，敲除 AURKAIP1 導(dǎo)致的涉及 Wnt/β-catenin 通路的某些關(guān)鍵分子的蛋白下調(diào)也被 DDX5 的過表達所有效逆轉(zhuǎn)（圖6J）。此外，檢測AURKAIP1、DDX5 和 β-catenin 之間的上下游關(guān)系，結(jié)果表明 AURKAIP1 可以在 β-catenin 的上游發(fā)揮正調(diào)控作用（圖 6K-M）。最終，AURKAIP1在TNBC中的作用機制如圖7所示。至此，這些發(fā)現(xiàn)表明AURKAIP1在TNBC中可能具有新的腫瘤促進作用，首次表明AURKAIP1在人類癌癥中確實具有獨特的作用，而這種作用并不依賴于Aurora-A的調(diào)控。

圖6. AURKAIP1 通過靶向DDX5激活Wnt/β-catenin信號通路

圖7. AURKAIP1-DDX5-β-catenin軸在TNBC進展中的直觀表現(xiàn)

結(jié)論

       綜上所述，本研究表明AURKAIP1 上調(diào)并與 TNBC 的不良預(yù)后有關(guān)。AURKAIP1可直接與DDX5蛋白相互作用并穩(wěn)定DDX5蛋白，提高其表達和β-連環(huán)蛋白活性。siRNA治療AURKAIP1可減緩腫瘤生長，這預(yù)示著AURKAIP1對TNBC的腫瘤發(fā)生和侵襲性至關(guān)重要。既然AURKAIP1可以在TNBC中發(fā)揮不可忽視的作用，那么它的額外蛋白質(zhì)伴侶和人類癌癥的潛在機制值得深入研究。

實驗方法

       生物信息學(xué)分析，細胞培養(yǎng)，實時定量PCR，細胞瞬時轉(zhuǎn)染和構(gòu)建穩(wěn)定細胞系，體外細胞增殖和遷移實驗，WB，CoIP，TOP/FOP熒光素酶報告實驗，免疫熒光，免疫組化，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性檢測，體外泛素化測定，TNBC 異種移植體內(nèi)腫瘤模型

參考文獻

       Tian W, Tang Y, Luo Y, Xie J, Zheng S, Zou Y, Huang X, Wu L, Zhang J, Sun Y, Tang H, Du W, Li X, Xie X. AURKAIP1 actuates tumor progression through stabilizing DDX5 in triple negative breast cancer. Cell Death Dis. 2023 Dec 1;14(12):790. doi: 10.1038/s41419-023-06115-1. PMID: 38040691; PMCID: PMC10692340.