IL1RN剪接產(chǎn)生的炎癥檢查點(diǎn)為KRAS突變型肝內(nèi)膽管癌提供了治療機(jī)會(huì)

       KRAS突變與促腫瘤炎癥有因果關(guān)系，并被確定為腫瘤發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素。在這里，使用從大量患者收集的多組學(xué)數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)KRAS突變與與肝內(nèi)膽管癌(iCCA)髓系炎癥相關(guān)的選擇性mRNA剪接的特定景觀相關(guān)。然后，作者確定了一種負(fù)反饋機(jī)制，其中白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL1RN)-201/203由于選擇性剪接而上調(diào)，在KRAS突變體iCCA中具有重要的抗炎作用。在KRAS突變型iCCA小鼠中，IL1RN201/203上調(diào)和anakinra治療通過(guò)改變中性粒細(xì)胞募集和表型引發(fā)了顯著的抗腫瘤免疫應(yīng)答。此外，anakinra治療協(xié)同增強(qiáng)抗PD-1治療，以激活KRAS突變型iCCA小鼠的瘤內(nèi)GZMB+ CD8+ T細(xì)胞。在臨床上，作者發(fā)現(xiàn)KRAS突變型iCCA患者的高IL1RN-201/203水平與抗PD-1免疫治療的良好反應(yīng)顯著相關(guān)。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1.髓系炎癥與iCCA的選擇性剪接和KRAS突變有關(guān)

       為了發(fā)現(xiàn)（選擇性mRNA剪接）AS在iCCA中的潛在作用，作者獲得了內(nèi)部生成和公開(kāi)的大量RNA-seq數(shù)據(jù)，包括496個(gè)iCCA樣本、22個(gè)非腫瘤肝臟樣本和188個(gè)正常組織樣本(心臟、肺等)(圖1A)。來(lái)自496個(gè)iCCA樣本的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)共獲得303,401個(gè)轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本被定位為5類，包括蛋白質(zhì)編碼基因(PC)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LNC)、假基因(PS)、未注釋基因(UNA)和其他非編碼RNA(ONC)。將AS指數(shù)與之前的iCCA分子亞型進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，AS指數(shù)高的樣本集中在與生存較差的炎癥相關(guān)亞組中(圖1B)?？紤]到作者最近提出的髓系炎癥在iCCA進(jìn)展中的重要作用，利用ssGSEA進(jìn)一步比較高和低AS亞組之間主要髓系細(xì)胞類型相對(duì)豐富度的差異。值得注意的是，高指數(shù)亞組有明顯更高的中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)(圖1C)。使用TIMER算法和先前報(bào)道的中性粒細(xì)胞特征(26-29)也獲得了類似的結(jié)果(圖1C)。對(duì)基因組改變與AS指數(shù)之間可能關(guān)聯(lián)的可視化熱圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，KRAS突變與高AS的關(guān)聯(lián)最為顯著(圖1C)，ssGSEA進(jìn)一步揭示了KRAS突變可能導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)，這一點(diǎn)在CPTAC隊(duì)列中通過(guò)CD6+B細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)的多重免疫組織化學(xué)(mIHC)染色得到了證實(shí)(圖1E，F)。最后，KRAS突變、高AS指數(shù)和髓系炎癥之間反復(fù)出現(xiàn)正相關(guān)，表明它們之間存在潛在的因果相互作用(圖1G)。綜上所述，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了iCCA中免疫抑制性髓系炎癥、腫瘤特異性ASEs和KRAS突變之間的密切聯(lián)系。

2.KRAS突變促進(jìn)IL1RN-201/203的表達(dá)和分泌

       鑒于KRAS突變與iCCA中腫瘤特異性ASEs之間的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)，作者試圖確定哪些腫瘤特異性ASEs特異性參與。特別是，IL1RN ASEs(IL1RN_MX)被確定為一個(gè)獨(dú)特的KRAS突變相關(guān)事件，使用多模態(tài)數(shù)據(jù)(圖2A)，然后通過(guò)RT-PCR分析驗(yàn)證IL1RN_MX。在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了兩種主要的IL1RN結(jié)構(gòu)變異，分泌型和細(xì)胞內(nèi)型。在IL1RN的6個(gè)蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本中，僅有胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄本變體IL1RN-201和IL1RN-203被發(fā)現(xiàn)參與IL1RN_MX，其中外顯子2a/2b的替代使用是它們之間的主要區(qū)別(圖2B)。然而，經(jīng)典分泌型變異IL1RN-205未參與。KRAS突變型iCCA患者中IL1RN_MX的PSI值顯著高于無(wú)KRAS突變的患者，這可能與KRAS突變型患者中IL1RN-201比IL1RN-203上調(diào)幅度更大有關(guān)。再次，作者發(fā)現(xiàn)iCCA患者中IL1RN-205的表達(dá)不受KRAS突變的影響。

圖1KRAS突變與iCCAAS指數(shù)和髓系炎癥相關(guān)

       然后作者在iCCA細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KRAS G12D，并觀察到與對(duì)照細(xì)胞相比，IL1RN-201在LICCF-KRAS細(xì)胞中的上調(diào)幅度是KRAS細(xì)胞G12D的13.93倍，而WTIL1RN-203僅上調(diào)4.15倍(圖2C)。來(lái)自CPTAC隊(duì)列的組織微陣列使用RNA熒光原位雜交(FISH)證實(shí)，KRAS突變患者的IL1RN-201和IL1RN-203分別比KRAS患者高10.89倍和6.19倍(圖2D-E)。

       先前的研究表明，細(xì)胞內(nèi)的IL1RN變異也可以通過(guò)一些未被探索的途徑從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來(lái)。事實(shí)上，Western blot(WB)和ELISA檢測(cè)表明，在KRAS過(guò)G12D表達(dá)LICCF或KRAS突變體HuCCT1細(xì)胞(iCCA)中，IL1RN-201或203過(guò)表達(dá)也導(dǎo)致它們?cè)谂囵B(yǎng)上清中大量積累，類似于分泌的IL1RN-205。

圖2 IL1RN-201/203在KRAS突變體iCCA中的產(chǎn)生機(jī)制及其功能

3.IL1RN-201/203抑制KRAS突變介導(dǎo)的髓系炎癥

       作為與KRAS突變相關(guān)的事件，IL1RN_MX的PSI與iCCA患者炎癥因子(CXCL3、CXCL5、IL1β等)、中性粒細(xì)胞、MAPK通路基因水平呈顯著正相關(guān)(圖2F)。考慮到IL1RN的抗炎作用，作者假設(shè)IL1RN-201/203可能通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)潛在地對(duì)抗KRAS突變體相關(guān)的髓系炎癥。

       為了驗(yàn)證這種可能性，作者構(gòu)建了IL1RN-201特異性敲低的LICCF-KRAS G12D細(xì)胞(shIL1RN-201)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，shIL1RN-201 LICCF-KRASG12D細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞暴露于條件培養(yǎng)基中，其遷移能力明顯高于對(duì)照細(xì)胞(圖2G)。相反，中性粒細(xì)胞暴露于IL1RN-201或203過(guò)表達(dá)HuCCT1細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中，其遷移量明顯低于載體對(duì)照HuCCT1細(xì)胞(圖2G)。此外，ELISA定量分析表明，shIL1RN-201或ASOIL1RN-201LICCF-KRAS細(xì)胞中CXCL3水平顯著高于對(duì)照組，而G12D過(guò)表達(dá)IL1RN-201或203的HuCCT1細(xì)胞中CXCL3水平顯著低于載體對(duì)照組(圖2H)。總之，這些數(shù)據(jù)表明IL1RN-201/203變體確實(shí)在KRAS突變型iCCA中起關(guān)鍵的抗炎作用。

       WB分析進(jìn)一步證實(shí)，IL1RN-201敲低后，ERK1/2磷酸化顯著增強(qiáng)，但被其過(guò)表達(dá)抑制(圖2I)。此外，ELISA檢測(cè)顯示，在shIL1RN-201LICCF-KRASG12D細(xì)胞、HuCCT1和ASOIL1RN-201LICCF-KRASG12D細(xì)胞中，曲美替尼(MEK-ERK途徑抑制劑)治療后，CXCL3水平降低(圖2J)。同樣，在shIL1RN-201LICCFKRASG12D、HuCCT1或ASOIL1RN-201LICCF-KRAS細(xì)胞中，使用抗CXCL3AB或AZD-5069(一種CXCR2抑制劑)治療后，transwell實(shí)驗(yàn)中的趨化能力也受到抑制(圖2K)。總的來(lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明IL1RN-201或203變體對(duì)ERK1/2-cxcl3中性粒細(xì)胞募集軸有顯著影響。

       接下來(lái)，作者研究了IL1RN-201或il1rn-203上游調(diào)控的可能機(jī)制。對(duì)CPTAC隊(duì)列轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的剪接因子進(jìn)行交叉分析，發(fā)現(xiàn)6個(gè)剪接因子在iCCA中低表達(dá)，同時(shí)存在KRAS突變和高AS指數(shù)，其中2個(gè)剪接因子在LICCF-KRAS細(xì)胞中也顯著低表達(dá)，G12D其中TFIP11的下調(diào)最為顯著(圖2L)。LICCF-KRAS細(xì)胞中TFIP11的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致IL1RN_MX的PSI值顯著G12D降低(圖2M)。此外，作者發(fā)現(xiàn)TFIP11與在曲美替尼處理的LICCF-KRASG12D和HuCCT1細(xì)胞中上調(diào)，但不上調(diào)p38抑制劑或JNK抑制劑(SP600125)，提示ERK1/2磷酸化對(duì)TFIP11表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(圖2N)。同樣，在曲美替尼治療的情況下，LICCF-KRASG12DandHuCCT1細(xì)胞中的TFIP11敲低也顯著增加了IL1RN_MX的PSI值(圖2O)。

       綜上所述，這些結(jié)果支持KRAS突變可以激活ERK1/2信號(hào)，從而觸發(fā)iCCA中以CXCL3中性粒細(xì)胞募集軸為特征的髓系炎癥。另一方面，ERK1/2磷酸化抑制剪接因子TFIP11，從而挽救IL1RN_MX的PSI值(即IL1RN-201/203的表達(dá))，以負(fù)反饋的方式進(jìn)一步抵消ERK信號(hào)(圖2P)。

4.IL1RN-201/203通過(guò)抑制KRAS突變型iCCA小鼠的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)來(lái)抑制腫瘤進(jìn)展

       為了評(píng)估IL1RN-201/203上調(diào)在體內(nèi)的影響，作者基于以往的研究建立了4個(gè)小鼠模型。RNA-seq分析表明，KRAS突變型YAK小鼠中與MAPK信號(hào)通路相關(guān)的DEGs顯著富集，與患者隊(duì)列中的數(shù)據(jù)一致(圖3C)。此外，YAK小鼠的中性粒細(xì)胞趨化和遷移途徑也上調(diào)(圖3C)，同時(shí)，在YAK腫瘤樣本中，富含“MAPK級(jí)聯(lián)負(fù)調(diào)控”的DEGs普遍上調(diào)(圖3C)。這一結(jié)果與在KRAS突變型iCCA患者中觀察到的ERK激活的負(fù)反饋反應(yīng)一致。此外，與IL1RN-201和204相似，iCCA腫瘤負(fù)荷原位評(píng)估顯示，過(guò)表達(dá)人源性IL1RN-201或203的YAK或KP腫瘤的腫瘤生長(zhǎng)顯著降低(圖3D)，而在未發(fā)生KRAS突變的YA或FA腫瘤中，無(wú)論IL1RN-201或203的表達(dá)如何，腫瘤負(fù)荷均未檢測(cè)到差異(圖3E)。IL1RN-201或203的過(guò)表達(dá)也導(dǎo)致YAK動(dòng)物的總存活率更高(圖3F)。同樣，作者發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素1受體拮抗劑anakinra在YAK小鼠(圖3D和圖3F)而不是YA小鼠(圖3E)中也具有相應(yīng)的腫瘤抑制作用。

       接下來(lái)，作者評(píng)估了過(guò)表達(dá)IL1RN-201/203或用anakinra治療的小鼠腫瘤中中性粒細(xì)胞的積累。scRNA-seq(圖3G)和免疫組織化學(xué)(IHC;圖3H)分析顯示，與對(duì)照組相比，IL1RN-201/203過(guò)表達(dá)或anakinra處理的YAK或KP小鼠腫瘤中中性粒細(xì)胞的比例和密度顯著降低。值得注意的是，在中性粒細(xì)胞缺失的小鼠中，無(wú)論阿那白拉治療還是IL1RN-201/203過(guò)表達(dá)，腫瘤負(fù)荷和小鼠存活率都是相似的(圖3IJ)。同樣，作者生成了YAK原位腫瘤轉(zhuǎn)基因小鼠，將白喉毒素(DT)應(yīng)答的2A-DTRGFP肽序列插入到Ly6G的停止密碼子中，以有效消除中性粒細(xì)胞，參考先前的報(bào)道。在這些小鼠中，IL1RN-201/203過(guò)表達(dá)和anakinra治療均未對(duì)腫瘤負(fù)荷產(chǎn)生明顯影響(圖3K)。然后，作者在YAK模型小鼠中測(cè)試了AZD5069的作用，發(fā)現(xiàn)AZD-5069顯著抑制中性粒細(xì)胞向腫瘤募集，并消除IL1RN-201/203過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤進(jìn)展的有益作用(圖3L)。這些數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)，IL1RN-201/203對(duì)KRAS突變體iCCA的影響依賴于中性粒細(xì)胞。

圖3 IL1RN-201/203對(duì)KRAS突變型iCCA小鼠的影響

5.IL1RN-201/203重編程中性粒細(xì)胞達(dá)到抗腫瘤表型

       腫瘤相關(guān)的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出功能異質(zhì)性和可塑性，包括抗腫瘤或促腫瘤表型。scRNA-seq分析在小鼠iCCA腫瘤中鑒定出6個(gè)中性粒細(xì)胞簇(圖4A)。然后，作者重點(diǎn)研究了小鼠腫瘤中檢測(cè)到的3種主要中性粒細(xì)胞簇(即CXCL2+，CXCR4+和LSP1+中性粒細(xì)胞，共占92.12%)，通過(guò)無(wú)偏倚的綜合跨物種分析，這些中性粒細(xì)胞簇的組成和特征基因表達(dá)在人和小鼠之間很大程度上是保守的。在通過(guò)mIHC驗(yàn)證了這些簇在YAK腫瘤中的存在后(圖4B)，作者進(jìn)行了表型分析，以更好地了解它們?cè)?span>KRAS突變體iCCA中的作用。

圖4 IL1RN-201/203對(duì)KRAS突變型iCCA小鼠中性粒細(xì)胞表型的影響

       然后，作者研究了IL1RN-201/203表達(dá)或anakinra治療是否以及如何影響牦牛小鼠的這些中性粒細(xì)胞簇。作者發(fā)現(xiàn)，在anakinra治療或過(guò)表達(dá)IL1RN-201/203的腫瘤中，CXCL2中性+粒細(xì)胞的比例顯著升高，但CXCR4+和LSP1+中性粒細(xì)胞的比例較低(圖4C)。RNA速度分析證實(shí)，CXCL2中性粒細(xì)胞+的明顯增加是由于CXCR4+和LSP1+中性粒細(xì)胞的加速轉(zhuǎn)化(圖4D)。重要的是，KRAS突變相關(guān)的髓系細(xì)胞發(fā)育和分化在CXCR4+和LSP1+中性粒細(xì)胞++中明顯減弱(圖4E)，而抗腫瘤免疫反應(yīng)，如IFN-γ反應(yīng)和T細(xì)胞活化，在所有3個(gè)中性粒細(xì)胞簇中都增強(qiáng)(圖4F)。這些結(jié)果表明，IL1RN201/203過(guò)表達(dá)或anakinra治療可能是中性粒細(xì)胞重編程以誘導(dǎo)腫瘤對(duì)T細(xì)胞敏感性的有效策略。

6.IL1RN-201/203促進(jìn)KRAS突變型iCCA小鼠GZMB+ CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)

       隨著中性粒細(xì)胞組成和功能的改變，免疫組化分析表明，在YAK和KP模型中，IL1RAN-201/203或anakinra治療組與對(duì)照組相比，瘤內(nèi)CD3+T細(xì)胞群顯著擴(kuò)增(圖5A)。然后，作者在Rag1-/-YAK模型中檢測(cè)腫瘤負(fù)荷，該模型缺乏成熟的T細(xì)胞和B細(xì)胞。正如預(yù)期的那樣，anakinra或IL1RAN-201/203治療組的小鼠在腫瘤發(fā)展方面沒(méi)有差異對(duì)照rag1-/-小鼠(圖5B)。隨后的mIHC分析顯示，在IL1RAN-201/203或anakinra處理組中，YAK和KP小鼠的CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯增加，而不是CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞(圖5C)。值得注意的是，在IL1RN-201/203過(guò)表達(dá)或anakinra處理的YAK和KP小鼠的腫瘤中，ly6中性粒細(xì)胞+和CD8T細(xì)胞+之間的距離明顯縮短。

       這些數(shù)據(jù)使作者想知道缺乏CD8+T細(xì)胞或其他亞群是否會(huì)影響IL1RAN-201/203或anakinra的抗腫瘤作用。HDTVi前1天通過(guò)抗CD8+B細(xì)胞清除CD8+T細(xì)胞，消除IL1RN-201/203和anakinra治療的效果(圖5D)。相比之下，CD4+T細(xì)胞或NK細(xì)胞的消耗對(duì)IL1RAN-201/203或anakinra的益處沒(méi)有明顯影響(圖5D)。這些結(jié)果表明，在KRAS+突變型iCCA小鼠中，CD8+T細(xì)胞特異性介導(dǎo)IL1RAN-201/203過(guò)表達(dá)或anakinra治療的抗腫瘤免疫。與IL1RN_MXPSI低KRAS突變體相比，IL1RN_MXP siKRAS突變體中CXCR4+和LSP1中性粒細(xì)胞的密度略有下降，而CXCL2中性粒細(xì)胞和GZMB CD8+T細(xì)胞+的密度則有所增加(圖5G-H)。這些觀察結(jié)果表明，重編程中性粒細(xì)胞可能與GZMB+CD8+T細(xì)胞協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。

7. Anakinra聯(lián)合抗PD-1Ab治療可增強(qiáng)KRAS突變體的抗腫瘤反應(yīng)  

       炎癥是癌癥免疫治療效果的主要障礙(9,39)。因此，作者接下來(lái)研究了anakinra是否可以提高KRAS突變YAK小鼠的PD-1阻斷效果。與單藥治療相比，抗PD-1Ab聯(lián)合anakinra確實(shí)進(jìn)一步降低了腫瘤負(fù)荷(圖6A)并提高了生存率(圖6B)。此外，作者評(píng)估了這種聯(lián)合療法是否也能使KRAS患者受益。正如預(yù)期的那樣，雖然抗PD-1治療顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，但在YA小鼠中，與anakinra聯(lián)合使用沒(méi)有額外的抗腫瘤功效(圖6C-D)。

圖5 IL1RN-201/203對(duì)KRAS突變體iCCA小鼠GZMB+CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的影響

       此外，anakinra聯(lián)合抗PD-1Ab可進(jìn)一步降低YAK模型中中性粒細(xì)胞的比例(圖6E)。然而，在抗PD-1Ab加阿那白那組中，GZMB+CD8+T細(xì)胞的比例顯著增加(圖6F)。這種效應(yīng)可能是由于聯(lián)合治療組中性粒細(xì)胞中Ccl5、Cxcl9、Cxcl10或Cxcl13的表達(dá)進(jìn)一步增加(圖6G)，這與實(shí)體腫瘤中CD8+T細(xì)胞通過(guò)其相應(yīng)受體浸潤(rùn)有關(guān)。隨后scRNA-seq分析表明，在聯(lián)合治療或anakinra單藥治療后，GZMB+CD8+T細(xì)胞中富集了一些效應(yīng)記憶分子、整合素、新抗原特異性標(biāo)記物、功能性轉(zhuǎn)錄因子和共刺激分子(圖6H)，這些已被用于預(yù)測(cè)癌癥免疫治療的益處。此外，抗PD-1Ab加阿那白素治療后，GZMB+CD8+T細(xì)胞中富集的生物過(guò)程與參與免疫反應(yīng)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫的正向調(diào)節(jié)途徑，進(jìn)一步說(shuō)明了阿那白拉與抗PD-1Ab治療在KRAS突變體iCCA中的協(xié)同作用(圖6I)。這些數(shù)據(jù)提供了anakinra與抗PD-1Ab聯(lián)合使用進(jìn)一步調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞簇、細(xì)胞毒性T細(xì)胞及其相互作用的證據(jù)。

圖6阿那白素聯(lián)合抗PD-1治療KRAS突變型iCCA小鼠的療效

8.高IL1RN-201/203水平或anakinra治療在KRAS突變患者中啟動(dòng)PD-1阻斷腫瘤

       接下來(lái)，作者研究了YAK小鼠中IL1RN-201/203過(guò)表達(dá)或anakinra是否也能改善KRAS突變型iCCA患者對(duì)抗pd1免疫治療的反應(yīng)。作者從本中心接受抗PD-1治療的KRAS突變型iCCA患者中收集了12例治療前活檢樣本，包括3項(xiàng)II期試驗(yàn)(NCT04961788、NCT04669496和ChiCTR2000035901)。FISH檢測(cè)顯示，與無(wú)反應(yīng)組相比，反應(yīng)組中IL1RN-201/203的表達(dá)顯著升高(圖7A-B)。與作者的上述結(jié)果一致，反應(yīng)組CXCR4和LSP1+中性+粒細(xì)胞密度均弱降低，而CXCL2+中性粒細(xì)胞和GZMB+CD8+T細(xì)胞密度弱增加(圖7C-D)。這些數(shù)據(jù)表明，IL1RN-201/203表達(dá)升高的KRAS突變iCCA患者具有相對(duì)有利的免疫治療TME。然后，作者分析了5種不同類型的KRAS突變頻率高(>20%)的患者的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)。

圖7 IL1RN-201/203或anakinra使KRAS突變癌癥對(duì)免疫治療敏感

       然后，作者使用一種新的患者源性腫瘤片段(PDTF)平臺(tái)來(lái)測(cè)試抗PD-1Ab單獨(dú)或加anakinra是否可以類似地重塑人類TME。在抗PD-1Ab±anakinra存在或不存在的情況下，對(duì)處理未成熟iCCA(n=5)和結(jié)直腸癌(n=8)手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行組織切片和體外培養(yǎng)。通過(guò)多參數(shù)細(xì)胞因子/趨化因子陣列和ELISA檢測(cè)，在培養(yǎng)48小時(shí)后分析這些PDTF分泌譜的變化(圖7E)。與作者的上述結(jié)果一致，KRAS突變體樣本的基線CXCL3水平和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)均高于KRASWT樣本。此外，與抗PD-1單藥治療的PDTF相比，接受anakinra抗PD-1+Ab聯(lián)合治療的6例KRAS突變患者的PDTF中CXCL9、CXCL10和GZMB的水平顯著升高，CXCL3等免疫抑制因子降低(圖7F)。這些結(jié)果表明，聯(lián)合治療誘導(dǎo)TME的快速重編程，以促進(jìn)T細(xì)胞的積累和效應(yīng)活性，這可能是有希望精確治療KRAS突變患者。

結(jié)論：

       本研究提出了AS的全面概況，并確定了由IL1RN選擇性剪接產(chǎn)生的新的炎癥檢查點(diǎn)，這為治療KRAS突變iCCA提供了有效的選擇。更廣泛地說(shuō)，對(duì)這種負(fù)反饋回路的深入研究將揭示KRAS突變癌癥的獨(dú)特生物學(xué)，從而推動(dòng)對(duì)受影響患者的靶向策略的探索。

實(shí)驗(yàn)方法：

       RNA提取和RNA測(cè)序，AS指數(shù)建立，ssGSEA評(píng)估免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，富集分析，WES數(shù)據(jù)分析，scRNA測(cè)序，mIHC分析,FISH檢測(cè)，質(zhì)粒和慢病毒介導(dǎo)的細(xì)胞系構(gòu)建，ASOs轉(zhuǎn)染，Western Blot，RT-PCR，Trsanswell試驗(yàn)，ELISA實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

       Zhang, M., Huang, Y., Pan, J., Sang, C., Lin, Y., Dong, L., Shen, X., Wu, Y., Song, G., Ji, S., Liu, F., Wang, M., Zheng, Y., Zhang, S., Wang, Z., Ren, J., Gao, D., Zhou, J., Fan, J., Wei, W., Gao, Q. (2023). An Inflammatory Checkpoint Generated by IL1RN Splicing Offers Therapeutic Opportunity for KRAS-Mutant Intrahepatic Cholangiocarcinoma. Cancer discovery, 13(10), 2248–2269.