USP13通過改變肺棒狀細胞譜系可塑性來驅(qū)動肺鱗狀細胞癌
肺癌是最常見的癌癥，也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌（SCLC）是兩種最常見的肺癌。NSCLC占肺癌病例的85%以上，分為肺腺癌（LUAD，50%）、肺鱗狀細胞癌（LUSC，30-40%）和大細胞癌。大多數(shù)LUSC患者被診斷時已處于晚期，靶向治療有限。譜系可塑性即細胞從一種分化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌矸莸哪芰?，與腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、腫瘤亞型之間的組織學轉(zhuǎn)變以及肺癌治療耐藥的潛在機制有關(guān)。細胞起源影響腫瘤的組織類型、惡性程度、譜系可塑性和腫瘤微環(huán)境。LUSC的起源細胞被假設(shè)為基底樣干細胞、AT2細胞、細支氣管肺泡干細胞和小氣道的棒狀細胞。細胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動了多種肺癌類型。人肺鱗癌由正常氣道上皮發(fā)展而來，并通過增生、鱗狀上皮化生、不典型增生和癌進展。然而并非所有的癌前病變都注定會進展為浸潤性LUSC，尚不完全清楚哪些分子變化建立了每個階段并驅(qū)動進展。超過90%的人類LUSC表現(xiàn)出染色體3q26拷貝數(shù)增加，這是LUSC的遺傳標志。值得注意的是，這個3q26擴增子包含SOX2和許多其他潛在的驅(qū)動或修飾基因，這些基因可能與LUSC發(fā)生的生物學和治療相關(guān)。USP13與人LUSC的癌基因PI3CA和SOX2一起位于染色體3q26擴增子上。USP13作為一種去泛素化酶，通過去泛素化過程調(diào)節(jié)多種底物蛋白的穩(wěn)定性，從而促進或抑制腫瘤。該研究發(fā)表在《Molecular Cancer》，IF：37.3。
技術(shù)路線：
主要研究結(jié)果：
1. USP13在NSCLC中高擴增，且與不良預(yù)后相關(guān)
USP13基因拷貝數(shù)在人LUSC和其他幾種癌癥（包括卵巢癌、食管癌和頭頸癌）中高度擴增（圖1A）。癌癥基因組圖譜（TCGA）基因組學顯示，91%（427例）的肺鱗狀細胞癌和29%（145例）的肺腺癌中有USP13擴增（≥5拷貝）或獲得（1~3拷貝）（圖1B）。USP13與染色體3q26-28位點內(nèi)的鱗狀細胞譜系因子SOX2和TP63緊密定位，并在肺鱗狀細胞癌和肺腺癌中共擴增（圖1B）。在肺鱗狀細胞癌和肺腺癌中，超過一半的USP13拷貝數(shù)增加/擴增與KRAS基因改變同時發(fā)生（圖1B）。在肺鱗狀細胞癌和肺腺癌中，USP13 mRNA水平隨著基因拷貝數(shù)的增加而升高（圖1C）。USP13 mRNA高表達的肺鱗癌患者無復(fù)發(fā)生存率較差。USP13高表達的肺腺癌患者總生存率降低（圖1D）。在人類肺鱗癌和肺腺癌組織芯片中的免疫組織化學（IHC）分析顯示，USP13蛋白在正常人類肺組織中幾乎不表達，而肺鱗癌樣本中USP13的表達水平是正常肺組織的16.7倍。USP13蛋白在所有級別的肺鱗狀細胞癌患者中均升高（圖1E）。在肺腺癌組織樣本中，USP13的表達水平是正常癌旁組織的1.5倍（圖1F）。
圖1 USP13在NSCLC中高度擴增，并與不良生存相關(guān)
2. USP13驅(qū)動Kras/Trp53突變小鼠肺鱗狀細胞癌的發(fā)展
為了研究3q26擴增子中的USP13在肺腫瘤發(fā)生中的作用，作者將USP13敲入（KI）小鼠模型（Usp13LSL/LSL，U）與KrasG12D/+（K）和Trp53flox/flox（P）小鼠雜交，產(chǎn)生KrasLSL-G12D/+；Trp53flox/flox；Usp13LSL/LSL（KPU）。通過在小鼠肺上皮內(nèi)給予表達Cre重組酶的腺病毒（Ad5-CMV-Cre）誘導(dǎo)肺部腫瘤的發(fā)生，導(dǎo)致致癌性Kras活化、Trp53純合缺失和Usp13過表達（圖2A）。首先觀察到KPU小鼠的生存期明顯短于KrasG12D/+；Trp53flox/flox（KP）小鼠（圖2B）。在Ad5-CMV-Cre病毒誘導(dǎo)后的10-14周，KP和KPU小鼠的所有肺葉均可檢測到腫瘤。盡管產(chǎn)生的腫瘤結(jié)節(jié)較少，但KPU驅(qū)動的每個腫瘤的大小顯著大于KP驅(qū)動的腫瘤（圖2C，D）。
通過免疫組化分析進一步檢查KP和KPU腫瘤。KP腫瘤表達LUAD標志物，包括NKX2-1和SPC（圖2E）。KPU腫瘤強表達鱗狀細胞標志物（SOX2和CK5），而腺癌標志物顯著下調(diào)（圖2E）。作者還通過免疫印跡分析證實了KP和KPU腫瘤裂解物中LUAD和LUSC標志物的差異表達。在KPU腫瘤溶解物中，NKX2-1和CK7信號被下調(diào)，而p63異構(gòu)體的表達被改變，SOX2被上調(diào)（圖2F）。根據(jù)免疫組織化學特征，對KP和KPU的每個腫瘤結(jié)節(jié)進行腫瘤亞型分型。所有KP腫瘤均被確定為腺癌（圖2G）。兩種主要的肺亞型LUAD和LUSC，在以鱗狀組織為主的大尺寸腫瘤結(jié)節(jié)的KPU小鼠中觀察到100%（圖2G，H）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)揭示了USP13的過表達在致癌的Kras激活和Trp53缺失的背景下驅(qū)動肺鱗狀細胞癌的發(fā)展。
圖2 在KP小鼠模型中，USP13過表達驅(qū)動肺鱗狀細胞癌的發(fā)展
3. 譜系重編程通路在KPU腫瘤中富集
為了分析KPU腫瘤的分子特征，進行批量RNA測序。與KP腫瘤相比，KPU腫瘤轉(zhuǎn)錄組表現(xiàn)出更大的異質(zhì)性，并被分為兩個不同的簇（KPU 1型和KPU 2型）（圖3A）。與組織病理學分析一致，在KPU腫瘤中，肺鱗狀細胞癌標記基因的表達水平升高，而肺腺癌標記基因的表達水平下調(diào)（圖3B）。值得注意的是，KPU 1型腫瘤同時表現(xiàn)出SCLC和LUSC標志基因的表達上調(diào)（圖3B）。與KP腫瘤相比，KPU腫瘤中有1050個差異表達基因（657個上調(diào)，393個下調(diào)）。標志性基因集的基因集富集分析顯示，KPU腫瘤高度富集于上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）通路（圖3C）。許多EMT相關(guān)基因，如Calu，Fn1，Vim和Snai2，在KPU腫瘤中表達上調(diào)（圖3D）。
作者進一步發(fā)現(xiàn)不同的信號通路在KPU 1型和KPU 2型中富集。Hedgehog和Notch信號通路在KPU 1型中富集，G2/M檢查點和PI3K/AKT/mTOR信號在KPU 2型中富集（圖3E）。KP和KPU轉(zhuǎn)錄組的獨創(chuàng)性通路分析（IPA）表明，USP13過表達導(dǎo)致與CREB信號、基底細胞癌信號、干細胞多能性和EMT相關(guān)的基因表達改變（圖3F）。
在IPA上游調(diào)控因子分析中，KPU腫瘤被預(yù)測激活由TWIST1，SNAI2，SOX2和MYC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)，這些轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動EMT，鱗狀細胞和譜系重編程（圖3G）。另一方面，LUAD譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子（NKX2-1和FOXA2）預(yù)計在KPU腫瘤中是無活性的（圖3G）。KPU腫瘤和人肺鱗狀細胞癌的比較分析發(fā)現(xiàn)，它們共享共同的轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子要么是共激活的，要么是失活的（圖3G，H）。根據(jù)不同的轉(zhuǎn)錄組特征，人類肺鱗狀細胞可分為4種亞型：原始型、經(jīng)典型、分泌型和基底型。KPU T1、KPU T3和KPU T4分別表現(xiàn)出與經(jīng)典、基底和原始人類肺鱗狀細胞相似的特征（圖3I）。綜上所述，KPU腫瘤表現(xiàn)出與人肺鱗狀細胞癌相似的分子特征，并顯示出強大的腫瘤可塑性和譜系重編程活性，這似乎與鱗狀細胞譜系標志物（SOX2）的上調(diào)，NKX2-1和FOXA2的下調(diào)，以及多能性因子（如MYC，NANOG和KLF4）的激活有關(guān)。
圖3 KPU腫瘤的轉(zhuǎn)錄組學特征
4. USP13和MYC在人肺鱗狀細胞癌和KPU鱗狀細胞癌中呈正相關(guān)
作者研究了USP13和MYC在人NSCLC中的關(guān)系。在人肺鱗狀細胞癌臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析聯(lián)盟（CPTAC）的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中，USP13、MYC和SOX2在蛋白水平上存在正相關(guān)（圖4A）。作者進一步使用IHC檢測了人NSCLC組織芯片中USP13、MYC和SOX2蛋白的表達。USP13、MYC和SOX2在肺鱗癌組織中的表達顯著高于肺腺癌組織（圖4B）。MYC和USP13蛋白表達水平在肺鱗狀細胞癌和肺腺癌組織中均呈正相關(guān)（圖4C，D）。
接下來作者研究了MYC在KP和KPU腫瘤中的表達。MYC在KPU腫瘤中強表達，主要在細胞核內(nèi)（圖4E）。特別是，MYC僅在KPU腫瘤的肺鱗狀細胞癌成分中升高，而在肺腺癌成分中沒有升高（圖4F），提示MYC表達的升高可能與KPU肺LUSC的進展有關(guān)。建立的原代KPU肺癌細胞MYC表達水平高于KP原代細胞（圖4G）。值得注意的是，外源性USP13過表達誘導(dǎo)了多種人NSCLC細胞株中MYC表達水平的上調(diào)（圖4H）。這些數(shù)據(jù)揭示了USP13與肺癌中MYC的水平和/或活性相關(guān)，并暗示了USP13和MYC在肺鱗癌發(fā)展中的潛在作用。
圖4 MYC蛋白在肺癌中通過USP13上調(diào)
5. USP13通過其去泛素化酶活性穩(wěn)定MYC蛋白
鑒于USP13在膠質(zhì)母細胞瘤和肝細胞癌中調(diào)節(jié)MYC的穩(wěn)定性，促進自我更新或致瘤潛能，作者假設(shè)USP13與肺癌中MYC蛋白豐度直接相關(guān)。過表達USP13顯著增加MYC在蛋白水平上的表達，但在mRNA水平上沒有顯著增加，表明USP13對MYC的翻譯后調(diào)控（圖5A）。USP13敲低后，外源性MYC表達水平顯著降低（圖5B）。免疫共沉淀顯示了USP13與MYC的相互作用（圖5C）。在放線菌酮追逐實驗中，外源性USP13過表達增強了MYC蛋白的穩(wěn)定性（圖5D）。
為了研究USP13的去泛素化酶活性對穩(wěn)定MYC的影響，作者首先檢測了Spautin-1（USP10/USP13去泛素化酶活性的小分子抑制劑）處理的HEK293T細胞中FLAG-MYC的水平。抑制USP13導(dǎo)致FLAG-MYC蛋白豐度降低（圖5E）。有趣的是，Spautin-1治療也導(dǎo)致USP13水平降低。USP13已經(jīng)描繪了功能域，即一個鋅指結(jié)構(gòu)域（ZnF）和兩個近端泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（UBA1/2）（圖5F）。作者試圖確定這些結(jié)構(gòu)域中哪些對MYC的穩(wěn)定至關(guān)重要。USP13的ZnF或UBA1/2結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致其增加MYC蛋白水平的能力下降，而兩個結(jié)構(gòu)域的缺失則完全消除了其上調(diào)MYC蛋白水平的能力（圖5G）。
過表達野生型USP13降低了泛素結(jié)合的MYC水平（圖5H）。然而，突變體USP13?Znf?UBA沒有同樣的作用（圖I）。相反，USP13的敲低增加了MYC的泛素水平（圖5J）。為了進一步研究USP13對MYC去泛素化的鏈特異性，作者將USP13與HA標記的泛素共表達，泛素攜帶一個位于K48，K63或K48R的賴氨酸殘基。免疫印跡數(shù)據(jù)表明，USP13作用于MYC上的K48連接的泛素鏈，而不是K63（圖5K）。這些結(jié)果表明，USP13通過切割MYC的K48連接的泛素結(jié)合來增加MYC蛋白的穩(wěn)定性。
圖5 USP13通過其去泛素化酶活性穩(wěn)定MYC蛋白
6. 在KPU模型中，棒狀細胞是肺鱗狀細胞癌的起源
為了研究肺祖細胞在KPU驅(qū)動的混合LUAD和LUSC腫瘤亞型中的作用，作者通過將Ad5-CC10-Cre或Ad5-SPC-Cre腺病毒分別在KPU小鼠的氣管內(nèi)遞送，在棒狀細胞和AT2細胞中誘導(dǎo)Cre重組酶的限制性表達（圖6A，B）。感染后12~14周，檢測兩組KPU小鼠的腫瘤負荷和組織病理學。AT2細胞靶向Ad5-SPC-Cre感染的KPU肺顯示肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量增加，但大小較小，并顯示腺癌組織學的存在。當KPU小鼠感染俱樂部細胞中的CC10-Cre病毒時，它們產(chǎn)生了明顯較大的具有鱗狀組織學特征的腫瘤（圖6C）。然后作者分析了肺癌譜系標志物NKX2-1和SOX2的表達。Ad5-SPC-Cre感染的KPU腫瘤大部分NKX2-1陽性，SOX2陰性，只有少數(shù)腫瘤NKX2-1陰性（圖D，E）。通過Ad5-CC10-Cre檢測，KPU肺內(nèi)大多數(shù)腫瘤被鑒定為NKX2-1陰性和SOX2陽性（NKX2-1-/SOX2+），盡管少數(shù)腫瘤表現(xiàn)出NKX2-1+/SOX2 -或NKX2-1+/SOX2+的特征（圖D，E）。接下來，作者檢測了這些因子在Ad5-SPC-Cre或Ad5-CC10-Cre病毒誘導(dǎo)的KPU小鼠腫瘤發(fā)展過程中的表達。從早期增生性病變到浸潤性癌，AT2細胞來源的腫瘤持續(xù)呈現(xiàn)NKX2-1+/SOX2-模式（圖6F）。CC10-Cre感染KPU肺后，細支氣管增生最初表現(xiàn)為兩種因子的陽性表達；然而，NKX2-1的表達隨后在原位癌（CIS）階段下調(diào)，在浸潤性癌中保持陰性（圖6F）。在Ad5-CC10-Cre感染的KPU肺中，NKX2-1水平顯著降低，而SOX2水平升高（圖6G）。這些數(shù)據(jù)表明，KPU小鼠的鱗狀細胞腫瘤起源于俱樂部細胞，而不是AT2細胞。此外，USP13可能參與了NKX2-1在肺鱗狀細胞癌發(fā)展早期的下調(diào)。
圖6 在KPU模型中，LUSC起源于CC10棒狀細胞
7. 在棒狀細胞來源的肺鱗狀細胞癌中，USP13抑制NKX2-1而上調(diào)SOX2
AT2細胞和棒狀細胞都被認為是KP誘導(dǎo)的LUAD發(fā)育的起源細胞。在之前研究中發(fā)現(xiàn)，CC10+棒狀細胞來源的細支氣管增生和腺瘤中SOX2呈陽性表達，但在腺癌中SOX2表達下調(diào)，導(dǎo)致LUAD譜系同質(zhì)。在KPU模型中，在KP遺傳改變背景下，棒狀細胞中USP13的過表達導(dǎo)致鱗狀細胞癌的發(fā)展。因此，作者進一步研究了分別遞送Ad5-CC10-Cre或Ad5-SPC-Cre病毒后KP和KPU模型的腫瘤進展情況（圖7A）。Ad5-CC10-Cre誘導(dǎo)的KPU肺發(fā)生了少量的腫瘤病變，但與KP肺相比，腫瘤較大（圖7B，C）。正如預(yù)期的那樣，棒狀細胞來源的KP腫瘤呈腺癌組織學，LUAD標志物（NKX2-1和SPC）表達陽性（圖7D）。
KPU腫瘤中SOX2的表達水平是KP腫瘤的5.2倍（圖7E）。有趣的是，CC10-Cre誘導(dǎo)的KP腫瘤也顯示SOX2陽性表達，并且其水平是異質(zhì)性的（圖7E）。在Ad5-CC10-Cre感染的KP和KPU肺中，KP和KPU細支氣管中的增生細胞染色顯示NKX2-1和SOX2均呈陽性（圖7F）。作者的數(shù)據(jù)表明，KP驅(qū)動的增生性病變和由棒狀細胞轉(zhuǎn)化的腺瘤均表達SOX2，但在更晚期的病變中，SOX2表達顯著降低和部分丟失（圖7F，G）。在CIS階段，KP和KPU小鼠肺組織中NKX2-1和SOX2的表達模式存在明顯差異。與KP模型相比，在KPU模型中，NKX2-1的表達在CIS階段顯著降低，而SOX2的表達在整個肺鱗狀細胞癌發(fā)展過程中顯著升高（圖7F，G）。
接下來，作者檢測了Ad5-CC10-Cre誘導(dǎo)后KP和KPU小鼠腫瘤發(fā)展過程中細胞身份標志物CC10和SPC的表達（圖7H）。KP和KPU的細支氣管增生性病變均表現(xiàn)為CC10+/SPC-。然后，從增生性病變到腺瘤和浸潤性腺癌，KP轉(zhuǎn)化的棒狀細胞從CC10+/SPC-逐步轉(zhuǎn)變?yōu)?span>CC10-/SPC+（圖7H）。相反，KPU癌沒有顯示SPC表達升高，顯示了CC10+/SPC-到CC10-/SPC-的不同譜系標志物轉(zhuǎn)換（圖7H）。這些數(shù)據(jù)提示USP13參與細胞譜系重編程，并將致癌性Kras介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的CC10+/SPC-棒狀細胞的命運轉(zhuǎn)變?yōu)?span>CC10-/SPC-，從而導(dǎo)致鱗狀細胞分化而不是腺癌進展（圖7I）。
圖7 在kp轉(zhuǎn)化的俱樂部細胞中，USP13表達增強可改變譜系因子的表達
8. USP13引起的MYC蛋白水平升高有助于促進鱗狀細胞癌的特征
鑒于人肺鱗狀細胞癌和KPU肺鱗狀細胞癌中USP13和MYC之間的強關(guān)聯(lián)，以及通過USP13的去泛素化活性實現(xiàn)的MYC蛋白的穩(wěn)定，作者檢測了Ad5-SPC-Cre或Ad5-CC10-Cre感染后KP和KPU腫瘤發(fā)生過程中MYC的表達模式。無論USP13是否過表達，Ad5KPU肺浸潤性鱗狀細胞癌的細胞質(zhì)和細胞核均檢測到MYC強表達（圖8D）。在Ad5-CC10-Cre感染的KP肺的CIS階段，MYC+細胞的比例急劇減少，并在腺癌發(fā)生過程中繼續(xù)減少（圖8A）。在人類，MYC已被報道主要在肺癌患者氣道的正常基底細胞的細胞質(zhì)中，但細胞質(zhì)中的MYC轉(zhuǎn)移到癌前病變和鱗狀細胞的細胞核中。同樣，在Ad5-CC10-Cre感染的KPU小鼠中，MYC在鱗狀上皮CIS病變處移位入核，MYC的核強表達在鱗狀上皮癌發(fā)展過程中持續(xù)存在（圖8A）。這些發(fā)現(xiàn)提示USP13的去泛素化活性可能在肺鱗狀細胞腫瘤發(fā)生的早期階段穩(wěn)定MYC蛋白，并且這種作用僅限于起源于棒狀細胞的鱗狀細胞腫瘤。
最近的一項研究提出MYC可能是與肺腺癌和肺鱗狀細胞癌組織學轉(zhuǎn)化相關(guān)的分子驅(qū)動因子。為了確定USP13是否可以通過MYC改變晚期肺腫瘤的譜系特征，作者在小鼠腺癌KP原代細胞系和人肺腺癌細胞系中過表達USP13，然后通過免疫印跡法檢測鱗狀細胞標志物，如SOX2，p40或CK5。單獨過表達UPS13可誘導(dǎo)鱗狀細胞標志物的表達（圖8C，D）。此外，MYC過表達也增加了鱗狀細胞標志物的水平（圖8C，D），這意味著USP13可以誘導(dǎo)小鼠和人肺腺癌細胞的MYC和鱗狀細胞譜系程序，并且MYC足以增強肺腺癌的特征。為了確定MYC是否需要USP13來上調(diào)SOX2的表達，作者敲低或抑制MYC，然后在H441細胞中過表達USP13。盡管MYC敲低，過表達USP13仍然導(dǎo)致H441細胞中SOX2水平升高（圖8E）。此外，在使用小分子c-MYC抑制劑10058-F4處理的情況下，USP13仍然上調(diào)了MYC抑制下SOX2的表達（圖8F），表明USP13可能以MYC依賴和MYC非依賴的方式與鱗狀細胞標志物相關(guān)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，USP13的過表達可能導(dǎo)致起源于棒狀細胞的腫瘤發(fā)展的初始階段MYC蛋白的增加，這可能有助于肺鱗狀細胞癌的發(fā)展。此外，作者發(fā)現(xiàn)USP13和/或MYC的過度表達在人類和小鼠肺腺癌中誘導(dǎo)鱗狀細胞譜系標記。
圖8 USP13可上調(diào)肺癌MYC的表達，促進肺鱗狀細胞癌特征的增強
結(jié)論：
該研究表明USP13在棒狀細胞的鱗狀細胞癌變過程中發(fā)揮開關(guān)作用，并且USP13介導(dǎo)的譜系重編程在細胞起源和遺傳背景中得到了至關(guān)重要的定義。USP13介導(dǎo)的去泛素化可導(dǎo)致MYC表達上調(diào)，這可能為肺鱗狀細胞癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)分化提供了新的分子機制。未來的研究需要確定USP13如何在USP13擴增的肺癌中重編程譜系可塑性，以及靶向USP13是否可以克服治療耐藥性的肺鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)化的肺腫瘤。
實驗方法：
小鼠實驗，細胞培養(yǎng)，免疫組化，免疫熒光，免疫印跡，實時熒光定量PCR，RNA-seq，通路富集，免疫沉淀，泛素檢測
參考文獻：
Kwon J, Zhang J, Mok B, Allsup S, Kim C, Toretsky J, Han C. USP13 drives lung squamous cell carcinoma by switching lung club cell lineage plasticity. Mol Cancer. 2023 Dec 13;22(1):204. doi: 10.1186/s12943-023-01892-x.