缺乏COL6/VI膠原通過損害自噬和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致巨核細(xì)胞功能障礙

        內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在結(jié)締組織疾病的分子病理中起著重要的作用。為了應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細(xì)胞可以上調(diào)巨噬/自噬，這是細(xì)胞降解和回收蛋白質(zhì)或去除受損細(xì)胞器的基本細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過程。在這些情況下，自噬激活可以支持細(xì)胞存活。在這里，我們通過體外和體內(nèi)方法證明，來自Col6a1-?-(膠原，VI型，α1)缺失小鼠的巨核細(xì)胞顯示COL6多肽的細(xì)胞內(nèi)保留增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡。未折疊蛋白反應(yīng)在col6a1-/-巨核細(xì)胞中被激活，這可以通過分子伴侶的上調(diào)、Xbp1 mRNA剪接的增加和促凋亡調(diào)節(jié)因子DDIT3/CHOP的高水平來證明。盡管內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，基底自噬在col6a1-/-巨核細(xì)胞中受損，表現(xiàn)為BECN1水平降低和自噬體成熟度降低。饑餓和雷帕霉素治療可挽救巨核細(xì)胞的自噬通量，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)COL6多肽潴留、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡減少。此外，Bethlem肌病和Ullrich先天性肌營養(yǎng)不良(兩種col6相關(guān)疾病)患者外周血造血祖細(xì)胞培養(yǎng)的巨核細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡增加、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬受損。這些數(shù)據(jù)表明，巨核細(xì)胞中膠原遺傳障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬調(diào)節(jié)可能是相互關(guān)聯(lián)的。該研究于2023年3月發(fā)表于《Autophagy》上，IF=13.3，題為“Lack of COL6/collagen VI causes megakaryocyte dysfunction by impairing autophagy and inducing apoptosis”。

技術(shù)路線

研究思路

1. Col6a1-/-Mks中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

        作者研究了COL6合成的改變是否會影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成的穩(wěn)態(tài)。RT-qPCR分析體外培養(yǎng)或直接從BM樣品中分選的Mks的UPR通路發(fā)現(xiàn)，Col6a1-/-細(xì)胞顯示編碼ATF4(激活轉(zhuǎn)錄因子4)和ATF6、PPP1R15A/GADD34(蛋白磷酸酶1，調(diào)節(jié)亞基15A)、HSPA5/Bip(熱休克蛋白5)、HSP90B1/GRP94(熱休克蛋白90，β (GRP94)，成員1)和膠原特異性伴侶SERPINH1/HSP47(絲氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制劑，分支H、成員1)，與野生型(WT)細(xì)胞相比，編碼XBP1 (X-box結(jié)合蛋白1)的轉(zhuǎn)錄本剪接增加(圖1A-C)。這些數(shù)據(jù)通過UPR關(guān)鍵調(diào)控因子的western blot分析得到證實。此外，Col6a1-/-Mks的特征是DDIT3/CHOP蛋白水平顯著升高(圖1d和E)，這是一種與PPP1R15A激活直接相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它有助于在未解決的慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中激活細(xì)胞死亡信號。UPR誘導(dǎo)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)改變，從而增加蛋白質(zhì)折疊能力。共聚焦和透射電鏡顯示，培養(yǎng)的Col6a1-/-Mks顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，這是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的典型標(biāo)志(圖1F-H)。通過直接染色Col6a1-/-BM活檢獲得的Mks證實了相同的形態(tài)畸。

圖1 Col6a1-/-Mks內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

2. Col6a1-/-Mks細(xì)胞內(nèi)COL6的積累

        與WT相比，在抗壞血酸存在下培養(yǎng)的Col6a1-/-Mks不能分泌COL6，這在培養(yǎng)基中或靠近細(xì)胞膜的地方是檢測不到的。此外，作者用COL6多克隆抗體共聚焦顯微鏡和COL6 α2鏈單克隆抗體western blot分析了COL6在Mks中的存在。這些實驗表明，與WT mk相比，Col6a1?/?中COL6鏈的細(xì)胞內(nèi)保留率顯著增加(圖2a和B)。

圖2 Col6a1-/-Mks細(xì)胞內(nèi)COL6的積累

3. Col6a1-/-Mks的基礎(chǔ)自噬激活缺陷

        為了深入了解自噬激活狀態(tài)，Mks被mCherry-EGFP-LC3B報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。這種結(jié)構(gòu)可以區(qū)分自噬體(mCherry EGFP)和自噬體與溶酶體(即自噬體)融合產(chǎn)生的晚期自噬結(jié)構(gòu)，在自噬體中，由于溶酶體依賴囊泡腔的酸化而發(fā)生EGFP破壞(mCherry EGFP+++ -)。Col6a1-/-Mks顯示自噬起始減少，LC3B點總數(shù)，WIPI2點數(shù)量和BECN1 (beclin 1，自噬相關(guān))蛋白水平顯示(圖3A和B)。此外，Col6a1-/-Mks顯示自噬體成熟減少，mCherry EGFP + - LC3B點的數(shù)量較低，僅mCherry點的百分比較低，表明基礎(chǔ)自噬通量減弱(圖3A-C)。這些數(shù)據(jù)通過使用溶酶體抑制劑氯喹處理Mks得到證實，隨后進(jìn)行LC3B和SQSTM1/p62周轉(zhuǎn)率的western blot分析(圖3D和E)。

圖3 Col6a1-/-Mks的基礎(chǔ)自噬激活不足

4. Col6a1-/-小鼠Mks和血小板凋亡增加

        為了研究UPR的誘導(dǎo)和基礎(chǔ)自噬通量的改變是否影響Mk凋亡，作者用ANXA5/annexin V和7-氨基放線菌素D (7-AAD)染色WT和Col6a1-/-Mks，測定細(xì)胞凋亡/壞死率。在體外和體內(nèi)，更高比例的Col6a1-/-Mks發(fā)生凋亡(ANXA5/annexin V 7-AAD+ -)，最終導(dǎo)致更高比例的壞死Mks (ANXA5/annexin V 7-AAD++)(圖4A和B)。與WT相比，Col6a1-/-Mks中促凋亡蛋白BAX與抗凋亡蛋白BCL2和BCL2L1/Bcl-xL的比例增加[21]證實了這些數(shù)據(jù)(圖4C和D)。與WT相比，Col6a1-/-小鼠的外周血血小板中ANXA5/annexin V+的比例更高(圖4E和F)， BAX與BCL2和BCL2L1/Bcl-xL的比例增加(圖4)。因此，Col6a1-/-小鼠的體內(nèi)血小板在外周血中被過早清除，t1/2減少了約30%(從大約1/2)。60 h至40 h)，通過跟蹤生物素標(biāo)記的血小板的體內(nèi)存活情揭示了這一點。為了證明Col6a1-/-小鼠中觀察到的血小板缺陷是否是血小板固有的，作者通過在Col6a1-/-小鼠中注入WT血小板和在WT小鼠中注入Col6a1-/-血小板進(jìn)行了互惠過繼轉(zhuǎn)移。通過這種方法，作者發(fā)現(xiàn)WT和Col6a1-/-外周血血小板都保持了原來的半衰期，從而表明半衰期的減少是血小板固有的，而不依賴于環(huán)境因素。

圖4 Col6a1-/-Mks和血小板在體外和體內(nèi)顯示出增加的凋亡

5.      饑餓和雷帕霉素處理可挽救Col6a1-/-Mks的自噬激活

        自噬受PI3K-AKT-MTOR通路調(diào)控，作者最近證實該通路在Col6缺乏的Mks中被過度激活。為了避免Col6a1-/-Mks顯示的基礎(chǔ)自噬誘導(dǎo)和自噬通量的減少，作者進(jìn)行了血清饑餓和雷帕霉素治療，這是兩種已知的自噬刺激[23-25]。兩種處理都恢復(fù)了MTOR通路的激活，并同時誘導(dǎo)了Col6a1-/-Mks中的自噬和自噬通量，這可以通過LC3B點的總數(shù)、mCherry EGFP+ -點的數(shù)量和僅mCherry點的百分比來證明(+圖5 A-C)。在血清饑餓和雷帕霉素治療下，用氯喹阻斷溶酶體功能導(dǎo)致Col6a1-/-Mks中LC3B脂化相對WT進(jìn)一步增加(圖5D)。這些處理也挽救了自噬底物SQSTM1/p62的積累(圖5E)，并誘導(dǎo)了Col6a1-/-Mks中WIPI2點的形成。

圖5 饑餓和雷帕霉素治療可挽救Col6a1-/-Mks的自噬激活

6. 饑餓和雷帕霉素處理可挽救Col6a1-/-Mks細(xì)胞內(nèi)COL6滯留、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡

        饑餓和雷帕霉素處理增加了WT和Col6a1-/-Mks中lc3b陽性自噬體和lamp2陽性溶酶體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位(圖6A-F)，隨后Col6a1-/-Mks中細(xì)胞內(nèi)COL6潴留量恢復(fù)到WT水平，共聚焦顯微鏡顯示(圖7A和B))。western blot分析培養(yǎng)基中分泌的COL6表明，饑餓和雷帕霉素處理后細(xì)胞內(nèi)COL6潴留的減少不是由于COL6的分泌。在bm衍生的Col6a1-/-Mks中，UPR通路在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的顯著減少與這種效應(yīng)相平行(圖7C-E)。透射電鏡顯示，血清饑餓和雷帕霉素處理后，Col6a1-/-Mks未觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學(xué)改變(圖7F)。為了證明饑餓和雷帕霉素治療后UPR激活的恢復(fù)是由于自噬激活，作者用自噬抑制劑氯喹治療Mks。在氯喹存在的情況下，兩種處理均未能使UPR標(biāo)記物的表達(dá)正?；Ｑ屦囸I和雷帕霉素處理對自噬誘導(dǎo)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響也對Col6a1-/-Mks的存活有顯著影響。事實上，7-aad染色的流式細(xì)胞術(shù)分析和BAX與BCL2和BCL2L1/Bcl-xL比例的western blot分析顯示，血清饑餓或雷帕霉素處理的Col6a1-/-Mks細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡顯著減少(圖7 G-J)。與未處理的對照組相比，體內(nèi)雷帕霉素處理顯著降低了Col6a1-/-bm分類的Mks的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬分子特征的誘導(dǎo)(圖7K和L)。正如作者最近發(fā)表的，體內(nèi)給藥雷帕霉素也僅在Col6a1-/-小鼠中誘導(dǎo)循環(huán)血小板數(shù)量顯著增加，達(dá)到WT水。

圖6 在WT和Col6a1-/-Mks中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與lc3b陽性自噬體和lamp2陽性溶酶體共定位

圖7 饑餓和雷帕霉素處理可挽救Col6a1-/-Mks細(xì)胞內(nèi)COL6滯留、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡

7. Col6相關(guān)疾病患者的Mks和血小板中細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬缺陷增加

        作者從伯利恒肌病和UCMD患者的外周血以及健康受試者的外周血中分化出Mks。來自患者的Mks在分子和蛋白質(zhì)水平上均顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)增加(圖8A-C))。此外，共聚焦顯微鏡顯示患者Mks的ER明顯擴(kuò)張(圖8D)。與來自健康受試者的Mks相比，來自患者的Mks在基礎(chǔ)條件下和使用氯喹阻斷溶酶體功能后顯示LC3B點的數(shù)量減少(圖8E)。

        最后，與健康對照者分化的Mks相比，患者分化的Mks表現(xiàn)出更多的凋亡和壞死(圖8F)。與健康受試者相比，患者外周血血小板的細(xì)胞凋亡率也較高(圖8G)。

圖8 來自Col6相關(guān)疾病患者的Mks表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡增加、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬缺陷

實驗方法

        細(xì)胞培養(yǎng)；動物建模；RT-qPCR；Western blotting；細(xì)胞轉(zhuǎn)染；免疫熒光；小動物成像；流式細(xì)胞術(shù)；

參考文獻(xiàn)：

        Abbonante V, Malara A, Chrisam M, Metti S, Soprano P, Semplicini C, Bello L, Bozzi V, Battiston M, Pecci A, Pegoraro E, De Marco L, Braghetta P, Bonaldo P, Balduini A. Lack of COL6/collagen VI causes megakaryocyte dysfunction by impairing autophagy and inducing apoptosis. Autophagy. 2023 Mar;19(3):984-999. doi: 10.1080/15548627.2022.2100105. Epub 2022 Jul 20. PMID: 35857791; PMCID: PMC9980446.