CTNNB1突變型肝細胞癌中靶向MMP9 可恢復CD8+ T細胞介導的抗腫瘤免疫并提高抗PD-1功效

         在肝細胞癌（HCC）中，功能增強（GOF）CTNNB1突變（CTNNB1GOF）引起明顯的免疫逃逸，并對抗PD-1產(chǎn)生抗藥性。在這里，我們的目標是調(diào)查CTNNB1GOF HCC介導的免疫逃逸機制，并提出一種新的治療策略，以增強在HCC中抗PD-1的療效。進行RNA測序以識別與免疫逃逸相關(guān)的CTNNB1GOF的關(guān)鍵下游基因。利用體外共培養(yǎng)系統(tǒng)、小鼠皮下或正位模型、在條件基因敲除小鼠中的自發(fā)性腫瘤模型以及流式細胞術(shù)，探索基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）在腫瘤進展和免疫逃逸中的生物學功能。利用單細胞RNA測序和蛋白質(zhì)組學來深入了解MMP9的潛在機制。在CTNNB1GOF HCC中，MMP9顯著上調(diào)。MMP9抑制了CD8+ T細胞的浸潤和細胞毒性，這對于CTNNB1GOF引發(fā)抑制性腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）和抗PD-1抗性至關(guān)重要。從機制上講，CTNNB1GOF下調(diào)了sirtuin 2（SIRT2），導致促進β-連環(huán)蛋白/賴氨酸去甲基酶4D（KDM4D）復合物形成，促進MMP9的轉(zhuǎn)錄激活。HCC分泌的MMP9介導了CD8+ T細胞中slingshot蛋白磷酸酶1（SSH1）的脫落，導致抑制C-X-C motif趨化因子受體3（CXCR3）介導的G蛋白偶聯(lián)受體內(nèi)的信號傳導。此外，MMP9阻斷重塑了TIME，并增強了在HCC中抗PD-1療法的敏感性。CTNNB1GOF通過激活MMP9的分泌引起抑制性TIME。針對MMP9重塑TIME并增強CTNNB1GOF HCC中抗PD-1的療效。

         該研究于2023年12月發(fā)表在《Gut》，IF：24.5。

技術(shù)路線：

結(jié)果:

1、MMP9 在 CTNNB1GOF HCC 中表達上調(diào)

         為了識別由CTNNB1GOF驅(qū)動的激活基因，我們通過流體動力學尾靜脈注射（HTVi）激活的AKT/β-連環(huán)蛋白、c-Met/β-連環(huán)蛋白和c-Myc/β-連環(huán)蛋白的三種HCC模型構(gòu)建了具有CTNNB1GOF背景的三種類型。ΔN90-β-連環(huán)蛋白質(zhì)通過HTVi與另一個致癌基因質(zhì)結(jié)合，促使肝臟中的腫瘤發(fā)生。然后，使用流式細胞儀（FCM）和t-分布式隨機鄰域嵌入（t-SNE）分析對肝臟免疫微環(huán)境進行了分析。與先前的報告一致，在CTNNB1GOF HCC中，巨噬細胞和骨髓源性抑制性細胞的浸潤增加，而DCs、CD8+和CD4+ T細胞減少（圖1A–C）。與此同時，CD8+ Granzyme B+ T細胞減少，表明CTLs的細胞毒性受損。由于腫瘤負擔較高，實驗組的總生存期（OS）縮短。隨后，對三對模型進行了RNA-seq。韋恩圖顯示了3個上調(diào)基因（MMP9、PROCR、ZFP287）的重疊（折疊變化（FC）>1.0，p<0.05）（圖1D）。為了識別與免疫調(diào)節(jié)和不良預后相關(guān)的核心基因，我們通過在癌癥基因組學數(shù)據(jù)庫（TCGA）數(shù)據(jù)集中使用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（PPI網(wǎng)絡）和單變量COX回歸對ImmuneScore和StromalScore篩選的差異表達基因（DEGs）進行了分析。結(jié)果，確定了五個基因（CXCL5、MMP9、PLAUR、CLEC5A、ITGB6）（圖1E）。這兩個基因集的交集確定MMP9是潛在的CTNNB1GOF驅(qū)動基因，可能在HCC中重塑TIME。然后，驗證了MMP9在CTNNB1GOF腫瘤中高表達（圖1F）。

         MMP9在多個基因表達均衡數(shù)據(jù)庫中都被證實在HCC中上調(diào)。此外，根據(jù)Lu的單細胞測序數(shù)據(jù)，肝細胞中MMP9在HCC進展過程中呈最顯著升高（圖1G）。此外，我們使用國際癌癥基因組學聯(lián)盟數(shù)據(jù)集中的21基因特征調(diào)查了CTNNB1的活化狀態(tài)。結(jié)果顯示，在CTNNB1突變的活躍狀態(tài)下，MMP9上調(diào)（圖1H）。MMP9在CTNNB1GOF HCC中的上調(diào)也在同濟隊列中觀察到（圖1I和J）。與此同時，CTNNB1GOFMMP9高表達的腫瘤與更差的生存和較低的無病生存率相關(guān)（圖1K）。這些結(jié)果表明MMP9在CTNNB1GOF HCC中上調(diào)，并與不良預后相關(guān)。

2、MMP9通過誘導抑制性的免疫微環(huán)境（TIME）促進HCC的進展

         基因集富集分析（GSEA）顯示MMP9表達與TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中的抑制性免疫微環(huán)境（TIME）相關(guān)。MMP9在體外和BALB/c裸鼠的腫瘤增殖中幾乎沒有影響（圖2A）。然而，MMP9的敲低顯著減少了C57BL/6 J小鼠的腫瘤體積和重量（圖2B）。對兩組小鼠脾臟的流式細胞儀（FCM）分析確認，盡管T淋巴細胞的比例相近，但在BALB/c裸鼠中成熟的CD4+和CD8+ T細胞幾乎不存在。

         接下來，使用MMP9敲低處理的Hepa1-6細胞構(gòu)建了原位HCC模型，結(jié)果顯示明顯抑制了腫瘤形成并改善了生存（圖2C–E）。FCM分析顯示MMP9敲低組中總T淋巴細胞、CD8+和CD4+ T細胞增加，而巨噬細胞減少（圖2F和G）。同時，CD8+ T細胞中Granzyme B和干擾素γ（IFN-γ）的增加表明CTLs的細胞毒性增強（圖2H）。免疫組化（IHC）和多重免疫熒光（mIF）分析進一步證實了這些結(jié)果。盡管巨噬細胞的總數(shù)減少，但M2表型向M1表型的轉(zhuǎn)變得以觀察（圖2I）。隨后的分析顯示CD8+ T細胞中PD-1和T細胞免疫球蛋白和黏液結(jié)合域-3（TIM-3）減少（圖2J）。此外，使用CD44和CD62L標記CD8+和CD4+ T細胞的結(jié)果表明，在MMP9敲低后，免疫記憶反應水平提高（圖2J）?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明MMP9通過誘導抑制性的TIME促進了HCC的進展。

3、MMP9 抑制 CD8+ T 細胞的激活和遷移

         考慮到在MMP9下調(diào)后T淋巴細胞和巨噬細胞極化均發(fā)生了變化，我們通過消除CD4+ T細胞、CD8+ T細胞或巨噬細胞來進一步確定MMP9調(diào)控的特定免疫細胞亞群。分別使用抗CD4中和抗CD8中和抗補體進行原位HCC模型處理（圖3A）。通過FCM監(jiān)測清道夫的效果（圖3B）。CD8+ T細胞的消耗剝奪了MMP9下調(diào)的抑制腫瘤效果，導致更重的腫瘤負擔和縮短的生存期（圖3C–E）。相反，CD4+ T細胞和巨噬細胞的消耗無法恢復腫瘤生長。這些結(jié)果確認了抑制CD8+ T細胞對于MMP9促進腫瘤進展至關(guān)重要。

         為了揭示MMP9對CD8+ T細胞激活的影響，進行了體外共培養(yǎng)研究。小鼠脾臟CD8+ T細胞受到重組MMP9蛋白的刺激，并與Hepa1-6細胞共培養(yǎng)24小時（圖3F）。CD8+ T細胞的腫瘤毒性在MMP9刺激下呈劑量依賴性減弱（圖3G）。CD8+ T細胞在MMP9刺激下的細胞培養(yǎng)上清Elisa測定顯示，MMP9抑制了肌酸酶B、干擾素γ和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的分泌（圖3H）。為了描繪MMP9在CD8+ T細胞遷移中的作用，將腫瘤條件培養(yǎng)基（CM）添加到下層培養(yǎng)皿，并評估CD8+ T細胞向下層培養(yǎng)皿的遷移（圖3I）。結(jié)果表明MMP9抑制了CD8+ T細胞的趨化作用（圖3I）。此外，MMP9不影響CD8+ T細胞的增殖（圖3J）?？偟膩碚f，這些觀察結(jié)果表明MMP9阻礙了CD8+ T細胞的激活和遷移，導致了抑制性的免疫微環(huán)境。

4、MMP9 阻斷可改善 CTNNB1GOF HCC 中的 TIME 并增強抗 PD-1 功效

         基于抗PD-1的免疫療法已廣泛用于HCC治療，并且已報道腫瘤浸潤的CD8+ T細胞是抗PD-1療法的生物標志物。鑒于MMP9對CD8+ T細胞的影響，我們推測MMP9的阻斷可能增強抗PD-1療法的療效。

         為了評估MMP9阻斷對CTNNB1GOF HCC中抗PD-1療效的影響，我們在MMP9肝細胞條件敲除小鼠（MMP9F/F; MMP9-Alb-cre，以下簡稱MMP9Δhep）中構(gòu)建了CTNNB1GOF自發(fā)性腫瘤模型。在腫瘤形成后，一部分小鼠接受了抗PD-1抗體治療（圖4A）。通過肝形態(tài)學、H&E染色和免疫組織化學（IHC）的驗證，所有小鼠均被確定為攜帶CTNNB1GOF的HCC模型（圖4B）。值得注意的是，與其他組相比，接受抗PD-1抗體治療的MMP9Δhep小鼠顯示出顯著的腫瘤抑制和生存延長（圖4C，F）。流式細胞儀分析顯示，與其他組相比，接受抗PD-1治療的MMP9Δhep小鼠CD8+細胞顯著增加（圖4D）。CD8+ T細胞中Granzyme B和IFN-γ的增加表明CTLs的細胞毒性增強（圖4E）。此外，聯(lián)合治療組的多器官未觀察到病變，表明MMP9阻斷和抗PD1的聯(lián)合治療總體上是安全的。血常規(guī)和血生化分析顯示，聯(lián)合治療有效緩解了腫瘤負擔引起的肝臟和腎臟損傷。

         我們進一步引入了MMP-9-in-1，一種特異的MMP9抑制劑，選擇性靶向血漿蛋白飽和度（PEX）。類似地，MMP-9-in-1與抗PD-1聯(lián)合治療CTNNB1GOF HCC模型（圖4G）。一致地，與MMP-9-in-1或抗PD-1單獨治療相比，聯(lián)合治療導致更為顯著的腫瘤回歸和生存延長（圖4H1和L）。流式細胞儀分析顯示，聯(lián)合治療增強了CD8+ T細胞的浸潤和細胞毒性（圖4J和K）。聯(lián)合治療的安全性也通過相同的方式得到驗證。

         這些結(jié)果表明，MMP9阻斷有潛力重塑CTNNB1GOF HCC的免疫微環(huán)境，并增強對抗PD-1治療的敏感性。

5、β-連環(huán)蛋白介導的 SIRT2 抑制通過促進 β-連環(huán)蛋白/KDM4D 復合物的形成上調(diào) MMP9

         我們進一步研究了β-catenin調(diào)控MMP9的精確機制。在組裝轉(zhuǎn)錄復合物之前，β-catenin與各種蛋白相互作用形成不同的蛋白復合物，執(zhí)行不同的功能。據(jù)報道，KDM4D與β-catenin相互作用，導致MMP9啟動子上H3K9me3的去甲基化。SIRT2可以直接與β-catenin相互作用，抑制Wnt信號輸出，而抑制Wnt/β-catenin信號增強SIRT2啟動子活性。我們發(fā)現(xiàn)XAV939通過激活Wnt/β-catenin信號途徑促進了KDM4D的表達，并以劑量依賴和時間依賴的方式抑制了SIRT2的表達（圖5A，B）。共免疫沉淀（CoIP）結(jié)果驗證了β-catenin與KDM4D或SIRT2的結(jié)合（圖5C，D）。免疫熒光證實了在Hepa1-6細胞的細胞質(zhì)和細胞核中β-catenin與KDM4D或SIRT2的共定位（圖5E）。

         基于以上觀察，我們假設SIRT2和KDM4D可能與β-catenin競爭結(jié)合。CoIP結(jié)果表明，SIRT2的過表達顯著抑制了β-catenin與KDM4D的結(jié)合（圖5F，G）。此外，在KDM4D過表達的Hepa1-6細胞中，SIRT2的過表達限制了MMP9的上調(diào)（圖5H）。隨后，通過KDM4D敲除或SIRT2過表達誘導的MMP9蛋白的下調(diào)在laduviglusib的刺激下被逆轉(zhuǎn)（圖5I，J）。此外，KDM4D敲除或SIRT2過表達抑制了MMP9的表達，并導致TIME的激活，從而抑制了腫瘤的形成（圖5K–M）。這些結(jié)果表明，通過β-catenin抑制SIRT2促進了β-catenin/KDM4D復合物的形成，從而通過上調(diào)MMP9促使抑制性TIME的形成。

6、MMP9 抑制 CTNNB1GOF HCC 中 CD8+ CXCR3+ T 細胞的浸潤

         接下來，我們進行了scRNA-seq以探討MMP9在重塑TIME方面的機制。利用熒光激活細胞分選（FACS）從MMP9F/F和MMP9Δhep小鼠的CTNNB1GOF HCC組織中分離腫瘤CD45+細胞。對總CD45+細胞群體的無監(jiān)督統(tǒng)一流形逼近和投影（UMAP）分析確定了23個亞群（圖6A）。所確定的免疫細胞群體包括T細胞、髓樣細胞、NK細胞、B細胞、DCs和中性粒細胞。所有細胞都表達高水平的家庭基因ACTB，而免疫細胞是PTPRC+，AFP，表明我們的數(shù)據(jù)的準確性。這些細胞亞型在MMP9F/F和MMP9Δhep小鼠中是共享的（圖6A）。鑒于髓樣細胞的大比例，我們進行了單獨的分析以確定髓樣和非髓樣細胞的比例（圖6B）。

         在先前建立了MMP9在促進CD8+ T細胞依賴性HCC中的作用后，我們對CD8+ T細胞進行了無監(jiān)督聚類分析。結(jié)果揭示了六個不同的CD8+ T細胞亞型，即CD8 MKI67、CD8 CCR7、CD8 GZMM、CD8 CXCR3、CD8 PDCD1和CD8 ITGA4（圖6C）。特別是，MMP9Δhep樣本顯示了CD8 CXCR3細胞的最顯著增加（圖6D）。我們觀察到CD8 CXCR3細胞的轉(zhuǎn)錄譜與已報道的與效應T細胞功能相關(guān)的CD8 CX3CR1細胞一致。隨后，我們研究了CD8+ T細胞的動態(tài)免疫狀態(tài)。偽時間分析顯示，過渡過程始于CD8 CCR7細胞，通過以CD8 GZMM和CD8 CXCR3細胞為特征的中間細胞毒狀態(tài)，最終導致以CD8 PDCD1和CD8 ITGA4細胞為特征的增殖（CD8 MKI67細胞）或衰竭（圖6E）。為了進一步描繪過渡狀態(tài)，我們分別分析了來自MMP9F/F和MMP9Δhep樣本的CD8+ T細胞的軌跡。令人驚訝的是，CD8 CXCR3細胞主要分布在MMP9Δhep樣本中（圖6F，G）。因此，我們得出結(jié)論，MMP9敲除主要影響CD8+ CXCR3+ T細胞的浸潤和功能。這一結(jié)果得到了mIF染色實驗的進一步支持，確認了MMP9Δhep樣本中CD8+CXCR3+ T細胞的富集（圖6H）?；虮倔w論（GO）和基因組的京都百科全書（KEGG）通路富集分析表明，CD8+CXCR3+ T細胞特異地富集于G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體活性、調(diào)節(jié)T細胞激活、白細胞遷移和細胞黏附等方面（圖6I）。

7、MMP9 通過蛋白水解 SSH1 從 CD8+ T 細胞中脫落抑制 CXCR3 介導的 GPCR 細胞內(nèi)信號傳導

         我們假設MMP9介導了對CD8+ T細胞表面蛋白的裂解，從而抑制了GPCR介導的CXCR3內(nèi)部信號傳導。蛋白質(zhì)組學鑒定了在MMP9刺激后CD8+ T細胞中下調(diào)的26種蛋白質(zhì)（圖7A），這些蛋白質(zhì)富集于GTP酶活性、GDP磷酸酶活性、調(diào)節(jié)細胞質(zhì)鈣離子濃度和細胞遷移等過程（圖7B）。GSEA進一步證明MMP9刺激與多種膜轉(zhuǎn)運過程相關(guān)聯(lián)（圖7C）。同樣，MMP9抑制了CD8+ T細胞中CXCR3介導的ERK和AKT的磷酸化（圖7D）。與未受MMP9刺激的T細胞相比，受MMP9刺激的CD8+ T細胞的F-actin分散在細胞外緣，而在T細胞的前緣積聚（圖7E）。這些數(shù)據(jù)表明MMP9抑制了GPCR的CXCR3介導的內(nèi)部信號傳導。此外，在MMP9刺激下，促進定向細胞遷移和T細胞對抗原刺激的SSH1在CD8+ T細胞中顯著降低（圖7A，D）。 MMP9和SSH1之間觀察到的負相關(guān)提示了MMP9在SSH1裂解中的潛在作用。

         進一步研究了SSH1在CD8+ T細胞中的作用。CoIP和免疫熒光染色表明SSH1可以與CXCR3結(jié)合，但在MMP9介導的SSH1裂解時解離（圖7F，G）。在CXCL10刺激下，CD8+ T細胞中SSH1的敲除抑制了ERK和AKT的磷酸化刺激（圖7H），并阻礙了CD8+ T細胞的激活、遷移和極化（圖7I–L）。此外，SSH1的上調(diào)消除了MMP9誘導的CD8+ T細胞遷移和激活的抑制作用?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明MMP9通過裂解CD8+ T細胞表面的SSH1來阻礙GPCR的CXCR3介導的內(nèi)部信號傳導。

8、MMP9 為 HCC 免疫治療提供了有價值的治療靶點和生物標志物

         這些研究啟發(fā)我們提出通過靶向MMP9來開發(fā)新的治療方法。開發(fā)了一種新的抗MMP9兔單克隆抗體（mAb），并評估了其在臨床實踐中的潛在治療價值。無論是抗PD-1還是抗MMP9單藥療法都在一定程度上抑制了腫瘤生長（圖8A），而聯(lián)合治療則更顯著地抑制了腫瘤生長并延長了生存（圖8A和B）。流式細胞儀分析顯示聯(lián)合治療增強了CD8+ T細胞的浸潤和細胞毒性（圖8C）。此外，在治療組中沒有觀察到明顯的毒性，確保了抗MMP9 mAb的安全性?？偟膩碚f，這些結(jié)果顯示了抗MMP9 mAb的治療價值，抗MMP9和抗PD-1的聯(lián)合可能是HCC免疫治療的有前景的策略。

         在臨床上，我們通過肝切除術(shù)或活檢從同濟醫(yī)院收集了原發(fā)性HCC標本進行進一步的分析。在接受術(shù)后抗PD-1輔助治療的隊列中（n=38），免疫組化染色結(jié)果顯示，MMP9表達與β-連環(huán)蛋白和KDM4D呈正相關(guān)，而與SIRT2呈負相關(guān)（圖8D）。tSNE分析顯示，MMP9水平較高的患者腫瘤內(nèi)CD8+CXCR3+T細胞浸潤減少，CD8+T細胞細胞毒性減弱（圖8E）。此外，MMP9表達水平較高的患者術(shù)后復發(fā)的可能性較大，與MMP9水平較低的患者相比（圖8F）。類似地，對于接受抗PD-1新輔助治療的患者（n=40），MMP9水平較高導致抑制性TIME和對抗PD-1治療的響應率較低（圖8G–K）。

實驗方法：

         流式細胞術(shù)、tSNE、RNA-seq、scRNA-seq、免疫印跡、免疫共沉淀、RT-PCR、雙熒光素酶報告測定、免疫組織化學、多重免疫熒光染色、構(gòu)建質(zhì)粒、慢病毒轉(zhuǎn)導、細胞毒性測定、Transwell、F-肌動蛋白染色、串聯(lián)質(zhì)量標簽 (TMT) 標記的蛋白質(zhì)組學。

參考文獻：

         Cai N, Cheng K, Ma Y, et al. Targeting MMP9 in CTNNB1 mutant hepatocellular carcinoma restores CD8+ T cell-mediated antitumour immunity and improves anti-PD-1 efficacy. Gut.